桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响研究*

林燕俞忠明陈宇

1浙江省杭州市萧山区中医院浙江杭州311200

2浙江省中医药研究院浙江杭州310007

桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响研究*

林燕1俞忠明2陈宇2

1浙江省杭州市萧山区中医院浙江杭州311200

2浙江省中医药研究院浙江杭州310007

目的：研究桑黄对S180荷瘤小鼠的免疫功能作用。方法：采用对小鼠S180实体瘤的抑制作用、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、血清溶血素检测以及正常小鼠碳廓清试验。结果：桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠抑瘤率优于阳性对照组人参组，但与模型组比无显著性差异；桑黄水煎液高、低剂量组对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化作用优于阳性对照组人参组，但差异无统计学意义，且与模型组比无显著性差异；桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠T淋转、溶血素水平无明显影响；桑黄水煎液对正常小鼠碳廓清水平无明显影响。结论：桑黄水煎液的肿瘤免疫作用不明显，要深入研究其肿瘤免疫作用需进一步进行成分分离、纯化，进行不同部位的系统药效作用研究，以便客观评价其功效。

桑黄 S180荷瘤 小鼠 免疫功能 实验研究

桑黄是一种珍贵的多年生大型药用真菌，由于大多生长在桑属植物上且子实体为黄褐色而得名，始载于《本草纲目》。《药性论》记载桑黄味微苦、性寒，临床多用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血、带下、闭经等症[1]。桑黄的现代药理研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、保肝等功效。本文通过桑黄水煎夜对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响研究，来进一步评价其药理作用。

1 材料

1.1 动物：ICR种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号码：SCXK（沪）2008-0016，动物合格证号：2008001619934、2008001620192、2008001620612；动物均饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心，许可证号：SYXK(浙2009-0122)。

1.2 药物及试剂：桑黄水煎液（1.0g生药/ml，200ml/瓶）、人参提取液（0.8g生药/ml，25ml/瓶），均由中药研究中心提供；吲哚美辛肠溶片（25mg/片×100片，批号A110103），山西云鹏制药有限公司生产；二甲苯、冰醋酸（均为分析纯），杭州化学试剂厂生产。

1.3 仪器：GS-6R离心机（Beckman公司）；HR40-Ⅱ-A2医用净化工作台（A2型，30%外排，70%循环），青岛海尔特种电器有限公司；BS210S电子天平（Sartorius公司）；YXQ-208SD电热蒸汽灭菌器（嘉兴市中新医疗仪器有限公司）；UV1000紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；Yamato RE600旋转蒸发仪（日本yamato）；FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；YJ-40L/h型超纯水机（杭州余杭亚洁水处理设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品制备：分述如下。

2.1.1 桑黄水煎液制备：桑黄粉碎，称取200g，加8倍量水，浸泡30min，煎煮1h，滤过，滤渣加6倍量水，煎煮0.5h，滤过，滤渣加5倍量水，煎煮0.5h，滤过，合并滤液，浓缩至生药含量1g/ml的桑黄水煎液，4～8℃冷藏保存，供体内抗炎及肿瘤免疫作用试验。

2.1.2 人参水煎液的制备：别直参（购自浙江省立同德医院中药房），粉碎，加10倍量水，浸泡30min，煎煮提取1h，滤过，滤渣加8倍量水，煎煮提取0.5h，滤过，滤渣加6倍量水，煎煮提取0.5h，滤过，合并滤液，水浴浓缩至生药含量为0.8g/ml的人参水煎液，4～8℃冷藏保存，作为免疫试验的阳性对照用药。

2.2 桑黄水煎液对荷瘤小鼠免疫功能的影响：分述如下。

2.2.1 对小鼠S180实体瘤的抑制作用：ICR小鼠50只，全为雌性，适应性饲养3天后，均皮下注射S180细胞悬液（1×107个/ml）0.2ml/只，次日随机分组，分为5组，每组10只，称体重。实验设高剂量组（桑黄水煎液18.0g生药/kg）、中剂量组（6.0g生药/kg）、低剂量组（2.0g生药/kg）；并设人参对照组（2.0g/kg）及模型对照（蒸馏水25ml/kg）。各组连续灌胃给药17天，停药次日，称体重，处死小鼠、剥离实体瘤、称瘤重，计算抑瘤率（%），结果见表1。桑黄水煎液对小鼠S180实体瘤的抑瘤率为4.71%～23.83%，与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表1 桑黄水煎液对S实体瘤的抑制作用（±s）180

表1 桑黄水煎液对S实体瘤的抑制作用（±s）180

体重（g）组别瘤重(g)抑制率(%) 4.71 16.52 23.83 13.21—高剂量组中剂量组低剂量组人参组模型组实验前25.80±1.57 25.90±1.59 25.90±1.56 25.80±1.31 25.90±1.32实验后36.60±2.77 36.00±3.35 34.80±3.97 36.20±2.19 37.20±3.97 8.64±2.85 7.57±3.73 6.91±3.34 7.87±2.11 9.07±2.54

2.2.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验：分组及给药同2.2.1，实验同时设正常小鼠组，正常组小鼠10只，除正常组与模型对照组，各组连续灌胃给药17天，停药次日，称体重，脱颈椎法处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×1O7个/ml。采用刀豆蛋白（ConA）诱导的3H-TdR掺入法测定T淋巴细胞转化功能，结果见表2。S180模型小鼠T淋转水平有明显降低，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.05）；桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠T淋转水平无明显影响，与模型对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

2.2.3 血清溶血素检测(HC50检测法)：实验分组及给药同2.2.1，给药13天后，取5%（v/v）的羊血，每只小鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，分离血清。用SA缓冲液稀释血清（荷瘤动物组血清150倍稀释，正常对照组血清700倍稀释）。将稀释后血清1ml置试管内，依次加入10%（v/v）绵羊红细胞（SRBC）0.5ml，补体（用SA 1：7稀释）1ml。另设不加血清的对照管。37℃水浴中保温20min，冰浴终止反应。离心，取上清液1ml，加都氏液3ml，同时另取10%（v/v）SRBC 0.25ml，加都氏液4ml，充分混匀，放置10min后，于分光光度计540nm波长处以对照管作空白，分别测定各管OD值。计算半数溶血值（HC50），结果见表2。S180模型小鼠溶血素水平有明显降低，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01）；桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠溶血素水平无明显影响，与模型对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

2.2.4 小鼠碳廓清试验：实验分组及给药同2.2.1，各组连续灌胃给药17天，停药次日，每鼠尾静脉注入用生理盐水稀释4倍的印度墨汁，0.1ml/10g体重，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10分钟分别从内眦静脉丛取血2Oμl，并将其加到2ml 0.1%Na2CO3溶液中，分光光度计于60Onm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。第二次采血结束后，立即处死小鼠，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。计算吞噬指数，结果见表3。桑黄水煎液对正常小鼠碳廓清水平无明显影响，与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表2 桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠免疫功能影响（s）

表2 桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠免疫功能影响（s）

注：与正常对照组比较*P＜O.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜O.05。

HC50值27.7±23.6 35.5±34.1 37.5±34.1 79.4±46.0△37.5±32.1**212.9±88.9组别高剂量组中剂量组低剂量组人参组模型对照组正常对照组T淋转（cpm）8655.3±4224.7 5407.2±2510.4 6914.4±2315.5 6804.0±6245.6 5927.0±1909.1*13369.0±5591.4

表3 桑黄水煎液对小鼠碳廓清试验的影响（±s）

表3 桑黄水煎液对小鼠碳廓清试验的影响（±s）

组别吞噬指数4.279±0.414 4.245±0.830 4.220±0.486 4.645±0.678 4.192±0.634高剂量组中剂量组低剂量组人参组正常对照组体重（g）实验前24.5±1.84 25.0±1.12 24.7±1.77 24.8±1.28 25.0±1.13实验后28.9±3.12 29.7±2.29 29.4±2.85 29.6±2.47 29.8±2.95

3 讨论

桑黄中主要含有黄酮、三萜、多酚，以及多糖类成分，能够起到抗肿瘤、抗炎、降血脂等作用。免疫试验结果显示：桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠抑瘤率优于阳性对照组人参组，但与模型组比无显著性差异；桑黄水煎液高、低剂量组对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化作用优于阳性对照组人参组，但差异无统计学意义，且与模型组比无显著性差异；桑黄水煎液对S180荷瘤小鼠T淋转、溶血素水平无明显影响；桑黄水煎液对正常小鼠碳廓清水平无明显影响。如需深入研究桑黄的免疫作用，需进一步进行成分分离、纯化，进行不同部位的系统药效作用研究，才能得到更客观的评价。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1995：1967.

2016-09-29

浙江省科技计划项目桑黄抗肿瘤活性研究及在规模化人工栽培中的应用，编号：2012C33125