黄酒多酚对Hcy诱导的血管平滑肌细胞MMP-2/9表达与活性的影响

刘龙斌 孟立平 季政 许富康 池菊芳 郭航远

黄酒多酚对Hcy诱导的血管平滑肌细胞MMP-2/9表达与活性的影响

刘龙斌 孟立平 季政 许富康 池菊芳 郭航远

目的 探讨黄酒多酚（YWPC）对同型半胱氨酸（Hcy）诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达和活性的影响及其信号通路。方法 SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定，取4～7代细胞用于实验。YWPC组VSMCs分别用1、10、100mg/L的YWPC干预，采用Western blot法检测VSMCs中MMP-2、MMP-9、AKT、pAKT的表达情况；明胶酶谱检测VSMCs中MMP-2和MMP-9的活性。用IGF-1（3ng/ml）干预VSMCs 8 h激活PI3K/AKT通路后，用YWPC干预VSMCs，检测MMP-2、MMP-9的表达和活性。结果 Western blot结果显示，与Hcy组比较，YWPC组VSMCs中MMP-2/9的表达减少，pAKT表达减少（均P＜0.01）；明胶酶谱结果显示，与Hcy组比较，YWPC组VSMCs中MMP-2/9的活性降低。在加入IGF-1后,与对照组比较，IGF-1组VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表达和活性增加（P＜0.01）；与YWPC组比较，YWPC+IGF-1组VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表达和活性增加（P＜0.01）。结论 YWPC通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制Hcy诱导的VSMCs中MMP-2/9的表达和活性。

血管平滑肌细胞 黄酒多酚 PI3K/AKT 基质金属蛋白酶

黄酒采用红粬、糯米和水为原料，人工自然发酵酿制而成。现已证实黄酒中含有丰富的多酚、氨基酸、多肽、维生素、低聚糖、有机酸以及矿物质等有益于心脑血管健康的成分[1]。我们过去的研究已经证实黄酒不但可以抑制大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和迁移，而且可以抑制LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化形成[2-4]。大量的研究证实规律适量的饮用红酒具有心血管保护作用[5-6]，并且已经阐明红酒的心血管保护作用主要缘于其中的多酚类成分[7]。我们推测，黄酒主要也是通过多酚类物质发挥其心脑血管保护作用。基质金属蛋白酶（MMPs）和组织型基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）共同维持着细胞外基质的平衡，在动脉粥样硬化斑块的发生、发展中具有重要的作用[8-10]。本实验旨在研究黄酒多酚（YWPC）抑制同型半胱氨酸（Hcy）诱导的VSMCs中MMP-2/9的表达以及是否通过抑制PI3K/AKT途径来实现这一作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 SPF级SD大鼠购自浙江省医学科学院实验动物中心，雌雄不限，60d左右，体重150～180g；遗传背景为C57BL/6J 10代后雄性LDLR-/-小鼠（购于南京医科大学实验动物中心）。YWPC由上海中药制药技术有限公司分离提取，纯度约60%；乙醚、甲醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、甲醇购自杭州化学试剂有限公司；DMEM高糖培养基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和链霉素购自杭州吉诺公司；Hcy、雷帕霉素购自美国Sigma公司；DMSO购自美国MP Biomedicals公司，FBS购自美国GIBCO公司，MTT购自美国Emresco公司；DAPI购自瑞士Rcohe公司；兔抗akt、p-pakt多克隆抗体、兔抗大鼠SM-actin单克隆抗体、兔抗MMP-2/ 9、明胶购自美国ABCOM公司；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC标记的山羊抗兔IGg购自美国Jackson公司；蛋白免疫印迹以及明胶酶谱相关试剂购自江苏碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs原代细胞培养及鉴定采用组织贴块法培育大鼠胸主动脉VSMCs，采用形态学观察和细胞免疫荧光检测平滑肌肌动蛋白（SM-actin）鉴定VSMCs，通过SM-actin与DAPI核染之间的关系鉴定VSMCs的纯度[11]。取第4～7代细胞用于后续实验，细胞加干预因素时用含2.5%FBS的培养基。实验分为2部分，第1部分用以验证YWPC对VSMCs中MMP-2/9表达和活性的影响，将细胞分为对照组、Hcy组、YWPC1mg/L组、YWPC 10mg/L组及YWPC 100mg/L组，除对照组外所有细胞先用500 μmol/L Hcy干预12h，再用不同浓度的YWPC干预VSMCs。第2部分实验用以验证YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9表达和活性的机制，VSMCs分为对照组、IGF-1（3ng/ml）组、YWPC（10mg/L）组和YWPC+IGF-1组。

1.2.2 Western blot测定 VSMCs中 MMP-2/9、AKT/ pAKT的表达 在用不同浓度的YWPC干预48h之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE胶每孔加入20μl样品，80V 30min进行蛋白浓聚，120V 2h进行凝胶电泳，并用孔径0.45μm硝酸纤维素膜250mA 90min进行转膜。转膜完毕经常温下TBST洗膜×3、脱脂奶粉封闭2h后，以1∶1 000浓度加入兔抗鼠MMP-2一抗（或抗MMP-9、AKT/pAKT一抗），4℃孵育过夜，常温下TBST洗膜×3，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育后ECL化学发光法检测目标蛋白。暗室柯达胶片显影，Quantity one软件定量分析。

1.2.3 明胶酶谱法测定VSMCs中MMP-2/9的活性取20μl各组蛋白样品在含1μg/ml明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶片上电泳,待溴酚蓝到达凝胶底部，在室温下用含2.5%Triton X-100洗涤缓冲液平摇洗涤30min× 2；37℃摇床平摇孵育缓冲液（pH8.8，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2）。然后凝胶染色2 h（含0.1%考马斯亮蓝R-250溶液，10%冰乙酸，45%甲醇溶液，45%去离子水），脱色（10%冰乙酸，45%甲醇溶液，去离子水45%）直到蓝色背景下出现白色条带，即为MMP-2/9，用双蒸水冲洗终止脱色，用凝胶成像系统进行拍照，用Quantity One软件定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。

2 结果

2.1 VSMCs原代培养及鉴定结果 用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs，8d左右组织块周围有细胞爬出，2周后细胞融合可以传代。传代后细胞呈典型“峰谷”状排列生长，用SM-actin细胞免疫荧光鉴定VSMCs，DAPI核染之后确定细胞纯度在99%以上，见图1。

图1 大鼠主动脉VSMCs形态学及细胞免疫荧光鉴定结果（A：VSMCs呈典型的“峰谷”样生长，×100；B：免疫荧光结果显示SM-actin在细胞中高表达，×400）。

2.2 两种方法检测各组VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表达 见图2、3，表1、2。

由图2、3，表1、2可见，与对照组比较，Hcy组VSMCs中 MMP-2/9的表达均升高（均 P＜0.05）。Western blot法中，与Hcy组比较，YWPC不同浓度组VSMCs中MMP-2的表达均减少（P＜0.05或0.01），YWPC 10mg/L组、YWPC 100mg/L组VSMCs中MMP-9的表达均减少（P＜0.05或0.01）；明胶酶谱法中，与Hcy组比较，YWPC不同浓度组VSMCs中MMP-9的表达均减少（P＜0.05或0.01），YWPC 10mg/L组、YWPC 100mg/L组VSMCs中MMP-2的表达均减少（P＜0.05或0.01）。各组VSMCs中AKT的表达差异无统计学意义（P＞0.05），与对照组比较，Hcy组VSMCs中pAKT的表达升高（P＜0.05）；与Hcy比较，YWPC各浓度组VSMCs中pAKT的表达均减少（P＜0.05或0.01）。

图2 Western blot法检测各组VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表达电泳图

表1 Western blot法检测各组VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表达

图3 明胶酶谱法检测各组MMP-2/9的表达电泳图

表2 明胶酶谱法检测各组VSMCs中MMP-2/9的表达

2.3 两种方法检测IGF-1预处理后各组VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表达 见图4、5，表3、4。

图4 Western blot检测各组VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表达电泳图

表3 Western blot检测各组VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表达

图5 明胶酶谱法检测各组MMP-2/9及AKT、pAKT的表达电泳图

表4 明胶酶谱法检测各组MMP-2/9的表达

由图4、5，表3、4可见，与对照组比较，YWPC组VSMCs中MMP-2/9的表达均降低（均P＜0.05）；与YWPC组比较，YWPC+IGF-1组中MMP-2/9的表达均增加（均P＜0.05）。各组VSMCs中AKT的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，YWPC组VSMCs中pAKT的表达降低（P＜0.05）；与YWPC组比较，YWPC+ IGF-1组VSMCs中pAKT的表达增加（P＜0.05）。

3 讨论

红酒多酚由白藜芦醇、儿茶素、花青素等组成，通过调节血脂、改善血管功能、抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移等作用而发挥心血管保护作用。我们过去的实验已经证明YWPC具有抑制LDL受体基因敲除小鼠动脉粥样硬化的作用，然而其抑制小鼠动脉粥样硬化的具体机制尚未阐明[12]。在本实验中，我们证实了YWPC可以通过抑制PIK/AKT通路来抑制Hcy诱导的VSMCs中MMP-2/9的表达和活性，这可能是其具有抗动脉粥样硬化作用的机制之一。

MMPs的过度分泌和激活可以导致粥样斑块的纤维帽降解破裂、增加局部的炎症反应[13]。最近的研究还发现MMPs除了降解细胞外基质的作用之外，还可以通过降解细胞间黏附分子、诱导细胞分泌生长因子、激活其他的MMPs等路径调节细胞内信号，从而在血管重构的发生、发展中发挥重要的作用[13]。自从Oak等[14]发现红酒多酚主要通过降低MMP-2的表达和活性从而发挥抑制VSMCs增殖和迁移的作用，后续研究基本证实抑制MMP-2/9的表达和活性是红酒多酚抗动脉粥样硬化的主要机制之一[15]。我们的实验结果证明YWPC不仅可以抑制VSMCs中MMP-2/9的表达，还可以抑制MMP-2/9的活性。这可能是黄酒发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一。

PIk/AKT通路在VSMCs增殖和迁移以及表型转化中发挥着重要作用[16]，pAKT可以进一步激活mTOR/ P70S6K通路，增加p-P70S6K1的表达，最终增加VSMCs的增殖和迁移[17]。本研究表明YWPC可以抑制PI3K/ AKT通路，减少pAKT的表达。以上结果提示YWPC可能是经PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2的表达和活性。IGF-1是PI3K的激动剂，可以激活PI3K，增加pAKT的表达，在本实验中，在加入IGF-1（3ng/ml）之后，YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9的表达和活性的作用被逆转。以上结果证实YWPC是经PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2/9的表达和活性。

本实验也存在一定的局限性，黄酒中的多酚类物质是由不同的单体成分组成的混合物，究竟是其中的何种确切成分在发挥作用我们尚不清楚。

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Yellow wine polyphenol compounds inhibit homocysteine-induced expression of MMP-2/9 in vascular smooth muscle cells through inhibiting PI3K/AKT pathway

LIU Longbin,MENG Liping,JI Zheng,et al.Department of Cardiology,Shaoxing People's Hospital, Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect ofyellow wine polyphenolcompounds(YWPC)on expression ofMMP-2/9 in rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMCs)induced by homocysteine(Hcy)and its mechanism. Methods The primarily cultured VSMCs were incubated with 500μmol/L Hcy for 12h;then VSMCs were treated with YWPCs in concentration of 1mg/L, 10mg/L or 100mg/L,respectively.IGF-1(3ng/ml)was used to activate PI3K/AKT pathway.The expressions of MMP-2,MMP-9, AKT,pAKT in VSMCs were detected with Western blotting;the activity of MMP-2/9 was examined with gelatin zymography. Results Western blotting showed that compared with Hcy group,the expressions of MMP-2/9,pAKT in YWPC groups were decreased.Gelatin zymography demonstrated that compared with Hcy group,the activity of MMP-2/9 was decreased in the YWPC groups.Compared with control group,the expressions of pAKT,MMP-2/9 was increased in the IGF-1 group(P＜0.01). Compared with YWPC groups the expression of pAKT,MMP-2/9 was increased in YWPC+IGF-1 group(P＜0.01). Conclusion YWPC inhibits Hcy-induced expression ofMMP-2/9 in VSMCs by suppressing PI3K/AKTsignaling pathway.

Vascular smooth muscle cells Yellow wne polyphenolPI3K/AKT Matrix Metalloproteinase

2012-12-17）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省自然科学基金项目（LY14H020002）

312000 绍兴市人民医院心内科

郭航远，E-mail：ghangyuan@hotmail.com