山竹提取物对胃癌SGC-7901细胞的体外实验研究

王荣国 李凯强 章志坚 王强

山竹提取物对胃癌SGC-7901细胞的体外实验研究

王荣国 李凯强 章志坚 王强

目的 观察山竹提取物（GME）对人胃癌细胞SGC-7901增殖情况的影响，探讨其作用机制。方法 采用新型四氮唑盐法（MTS）检测GME对SGC-7901细胞增殖的影响；采用流式细胞仪检测GME对SGC-7901细胞凋亡和诱导活性氧（ROS）水平的影响；采用Western blot检测不同浓度GME对BGC-7901细胞的PTEN、Bax、Bcl-2表达的影响。结果 GME显著抑制SGC-7901细胞的增殖（P＜0.05），与阳性对照组5-氟尿嘧啶（5-FU）相比抑制率也较高（P＜0.05），其半数抑制浓度为：7.89μg/ml。经5、7.5μg/ml的GME处理24h后，可有效促进SGC-7901细胞凋亡（P＜0.05），ROS水平的累积；GME相同方式处理后，SGC-7901细胞中PTEN和Bax的蛋白表达量上调，Bcl-2蛋白表达量降低（P＜0.05）。结论 GME能够显著抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖，能够诱导SGC-7901细胞ROS水平的累积，并通过影响PTEN、Bax和Bcl-2蛋白的表达，促进其凋亡。

山竹提取物 增殖 胃癌 SGC-7901细胞

胃癌发病率极高，其病死率在所有癌症中居第二[1]。目前，消化道恶性肿瘤的治疗手段主要有手术、化疗、放疗、免疫、中药治疗等[2]。以胃癌为代表的消化道恶性肿瘤已成为我国主要的恶性肿瘤类型，因此，寻找安全、有效的新治疗手段是迫切需要解决的问题。山竹又称莽吉柿、凤果、倒稔子，属藤黄科藤黄属，常用于腹痛、腹泻、痢疾、感染性创伤、化脓、慢性溃疡、淋病等疾病的治疗[3]。本研究采用新型四氮唑盐法（MTS）检测山竹提取物（GME）组分对胃癌SGC-7901细胞的抑制率，流式细胞技术检测GME组分对SGC-7901细胞凋亡和活性氧（ROS）的影响Western bolt技术检测GME组分对SGC-7901细胞中PTEN、Bax和Bcl-2表达的影响，从而探索GME是否影响胃癌SGC-7901细胞及其影响机制。

1 资料和方法

1.1 细胞培养 将胃癌SGC-7901细胞系（由浙江省人民医院胃肠道重点实验室赠送）培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（美国invitrogen公司）中，在37℃、饱和湿度、含5%CO2、100U/ml青霉素/链霉素的培养箱内培养。48～72h传代，采用0.25%胰酶消化，1∶3传代后，取对数生长期细胞进行进一步实验研究。

1.2 MTS检测法 GME经萃取和色谱分离（由浙江工业大学药学院纯化和赠送）。将GME溶于二甲基亚砜（DMSO）配成高浓度的储存液，分别使用1、1.25、2.5、5、10、20μg/ml的GME处理SGC-7901细胞24h，阳性对照组采用8 000μg/ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）；采用MTS检测不同浓度GME对体外培养SGC-7901细胞增殖的影响，并根据吸光度（OD）值计算细胞增殖抑制率作图得到剂量-效应图谱[2]。实验重复3次，取3次实验数据的平均值。

1.3 流式细胞术检测细胞ROS水平和凋亡 分别使用0.10%DMSO、5μg/ml和7.5μg/ml GME处理SGC-7901细胞24h，使用流式细胞术（美国BD公司）检测3组SGC-7901细胞ROS和凋亡的差异[3]。

1.4 Western blot检测 分别使用0.10%DMSO、5μg/ ml和7.5μg/ml的GME处理SGC-7901细胞24h，抽提总蛋白（中国碧云天公司），定量后，10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量为30μg，半干式电转仪转膜30min，含5%脱脂奶粉的TBST（tris-Buffered saline Tween-20）室温封闭2h；用1%含脱脂奶粉的TBST稀释PTEN（美国Cell Signaling Technology公司），Bax（美国invitrogen公司），Bcl-2（美国invitrogen公司），β-actin（中国中杉金桥公司），4℃过夜，1×TBST洗3遍，二抗（中国中杉金桥公司）孵育2h，1×TBST洗3遍，使用ECL工作液与膜充分接触（约1min），使用Bio-rad化学成像系统显影。

1.5 统计学处理 采用Prizm 5统计软件，并计算半数抑制浓度（IC50）值。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 GME抑制细胞增殖的MTS实验 GME的SGC-7901的IC50值为为7.89μg/ml。与0μg/ml MTE组比较，1.25、2.5、5、10和20μg/ml MTE和阳性对照组（5-FU)对C6细胞增殖抑制率的差异均有统计学意义（均P＜0.05），且随MTE组分浓度的升高其抑制率增强（表1）。

表1 GME不同浓度对SGC-7901细胞增殖的影响

2.2 GME对SGC-7901细胞ROS的影响 5μg/ml和7.5μg/ml GME处理SGC-7901细胞24h后，流式细胞仪检测细胞ROS水平发现，GME能够促进SGC-7901细胞ROS水平的累积（图1）。

图1 GME对SGC-7901细胞ROS水平的影响

2.3 GME对SGC-7901细胞凋亡的影响 5μg/ml和7.5μg/ml GME处理24h后，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明DMSO对照组、5μg/ml和7.5μg/ml GME组的凋亡率分别为（1.08±0.17）%，（2.47±0.52）%，（11.11± 3.35）%；与DMSO对照组比较，7.5 μg/ml GME组凋亡差异具有统计学意义（图2），GME组的凋亡率随着GME浓度提高而提高（P＜0.05）。

2.4 GME影响PTEN、Bax和Bcl-2的蛋白表达 经5、7.5μg/ml GME处理后，SGC-7901细胞的PTEN和Bax蛋白表达量提高；Bcl-2蛋白的表达量减低（均P＜0.05）（图3）。

3 讨论

山竹是一类藤黄属植物，具有清热、解毒之效，既往常用于泌尿系统疾病的应用。近年来，有学者提出，藤黄酸在免疫调节、败毒抗癌中的功效有望应用于各类恶性肿瘤的治疗，已经进入临床Ⅱa期研究阶段，是藤黄的抗肿瘤活性成分之一[4]。然而，目前关于山竹对于癌细胞的作用机制研究尚不深入。故本研究中，采用GME在体外实验中研究它们对胃癌SGC-7901凋亡有无促进作用，期望为今后开发治疗肿瘤药物奠定实验基础。本研究应用自己提纯的GME对SGC-7901研究发现，GME对SGC-7901细胞的IC50显著低于阳性对照，且随着时间、浓度的提高，对SGC-7901细胞抑制增殖能力越强。进一步研究发现，GME处理后，SGC-7901细胞ROS水平显著提高，且随着浓度的提高凋亡加剧。在Western实验中，发现经GME处理后SGC-7901细胞的PTEN和Bax蛋白表达量显著上调，Bcl-2蛋白表达水平显著下调。众所周知，PTEN同时具有脂质和蛋白双重特异性磷酸酶活性的肿瘤抑癌基因，该基因的编码蛋白脂质磷酸酶的活性对细胞周期阻滞和调控细胞凋亡发挥重要的作用，其突变的高表达可以抑制细胞的迁移和黏附功能[5-6]。研究发现，癌基因Bcl-2的过表达会抑制细胞凋亡，促进肿瘤的增殖[7]，其家族的Bax与其相对立，Bax的表达量提高，阻碍肿瘤的发生和恶性转化[8]。此外，Park等[9]研究发现，细胞的ROS水平提高会导致Bax异位到线粒体，从而影响线粒体膜电位，激活Caspase3，Caspase9和PARP，随后导致细胞凋亡。通过促进PTEN和Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白，促进ROS的发生这一结果与流式细胞仪检测凋亡现象一致，进一步明确了GME对胃癌SGC-7901抑制增殖的作用机制。因此，寻找有效的治疗药物在抑制肿瘤形成，降低其生长速度从而改善患者预后具有重要的意义。

图2 GME对SGC-7901细胞凋亡的影响（a：DMSO对照组，b：5μg/ml GME组，c：7.5μg/ml GME组）

图3 GME对SGC-7901细胞PTEN、Bax和Bcl-2蛋白表达水平的影响

综上所述，山竹制剂能够明显影响SGC-7901细胞PTEN、Bax和Bcl-2的表达，提示山竹制剂将有可能通过调节细胞氧化，促进细胞凋亡而发挥抗肿瘤的目的。该研究对于筛选有益的传统中药抗癌成分，丰富中药的药理理论具有重要的意义，对今后科学提取和使用藤黄属类抗肿瘤活性成分具有指导价值，有待更深入的研究。

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Effect of Garcinia mangostana extract on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells in vitro

WANG Rongguo,LI Kaiqiang, ZHANG Zhijian,et al.Department of Gastrointestinal Surgery Surgery,Taizhou First People's Hospital,Taizhou 318020,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Garcinia mangostana Extract(GME)on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells. Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells were treated with 5μg/ml and 7.5μg/ml GME for 24h. SGC-7901 cell proliferation was determined by tetrazolium salt reduction method (MTS),cell apoptosis and reactive oxygen species(ROS)were measured by flow cytometry,PTEN,Bax and Bcl-2 protein expressions in SGC-7901 cells were detected by Western blot.Results GME significantly inhibited the proliferation ofSGC-7901 cells(P＜0.05)with a 50%inhibitory concentrations of 7.89μg/ml,the inhibition rate was higher than that of 5-fluorouracil(5-FU)(P＜0.05).After treated with 5 μg/ml and 7.5μg/ml of GME for24h,apoptosis ofSGC-7901 cells was increased(P＜0.05),and the cellROS levels was also increased;the expressions of PTEN and Bax proteins in SGC-7901 cells were increased,while Bcl-2 expression levels were reduced(P＜0.05). Conclusion This study suggests that GME can significantly inhibit proliferation ofSGC-7901 cells,enhance ROS levels,and promote apoptosis ofSGC-7901 cells,which is associated with up-regulation ofPTEN,Bax and down-regulation ofBcl-2 expression.

Garcinia mangostana extractProliferation Gastric cancer SGC-7901 cellline

2015-12-25）

（本文编辑：田云鹏）

浙江省中医药优秀青年人才基金（2014ZQ005）

318020 台州市第一人民医院胃肠外科（王荣国、章志坚、王强）；浙江省人民医院临床医学研究中心（李凯强）

王荣国，E-mail：s753456@163.com