藤黄酸对结直肠癌LOVO细胞增殖和血管生成素样蛋白4表达的影响

魏 建 昌曹杰 杨 平 曾山崎 王成兴 邱旭彬 陈华翠

广州医科大学附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180

藤黄酸对结直肠癌LOVO细胞增殖和血管生成素样蛋白4表达的影响

魏 建 昌曹杰▲杨 平 曾山崎 王成兴 邱旭彬 陈华翠

广州医科大学附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180

目的研究藤黄酸对结直肠癌LOVO细胞生长增殖和血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）表达的影响，探讨藤黄酸可能的抗肿瘤机制。方法采用不同浓度的藤黄酸干预结直肠癌LOVO细胞，分别于12、24、36 h后应用CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡情况，Western blot检测ANGPTL4蛋白表达。结果藤黄酸对结直肠癌LOVO细胞的生长和增殖具有抑制作用，该抑制作用呈现浓度依赖性和时间依赖性（P＜0.05）。藤黄酸阻滞LOVO细胞于G2/M期，阻滞作用呈现浓度依赖性（P＜0.05）。高浓度藤黄酸能够诱导LOVO细胞凋亡（P＜0.05）。藤黄酸抑制LOVO细胞ANGPTL4蛋白表达，ANGPTL4蛋白表达随藤黄酸作用浓度的增加而减少（P＜0.05）。结论藤黄酸能够抑制结直肠癌LOVO细胞的生长和增殖，阻滞LOVO细胞于G2/M期，并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与抑制ANGPTL4表达相关。

藤黄酸；结直肠癌；ANGPTL4

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是国内外最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，目前位居全球恶性肿瘤第3位[1-2]。术后复发转移是结直肠癌患者死亡的重要原因，是结直肠癌患者治疗的一大难题。结直肠癌发生、发展和侵袭转移机制仍未明确，其中，肿瘤微血管生成在该过程中有着重要意义[3]。藤黄酸（gambgic acid，GA）是中药藤黄的活性成分，具有多靶点的抗肿瘤作用，能通过多种机制来发挥作用。本课题组前期研究表明，藤黄酸能够通过抑制血管新生来抑制结直肠癌的生长和增殖[4-6]。血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）是新发现的一种分泌蛋白，是血管生成素样蛋白（angiopoietin-like proteins，ANGPTLs）家族的成员之一，与血管生成、能量代谢及肿瘤生长和转移密切相关[7-8]。本实验采用不同浓度藤黄酸作用结直肠癌LOVO细胞，研究藤黄酸对LOVO细胞增殖的影响并检测ANGPTL4蛋白表达，探讨藤黄酸可能的抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

藤黄酸（98%纯度），购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，保存于-20℃冰箱。结直肠癌LOVO细胞，贴壁单层生长，40%集落形成率，100%裸鼠致瘤性，由南京凯基公司供应。兔抗人ANGPTL4抗体，购自美国Abbiotec公司。

1.2 方法

1.2.1 LOVO细胞体外培养结直肠癌LOVO细胞放置于37℃，5%CO2培养箱中培养。RPMI1640培养液中加入10%小牛血清、100 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素。

1.2.2 CCK-8法检测细胞生长、增殖对数生长期LOVO细胞以1×105个/孔数量接种于96孔培养板，培养24 h，去除培养液，加入浓度分别为0、1.0、2.0、4.0 mg/L浓度的藤黄酸溶液，每孔200 μL，各组细胞培养12、24、36 h后，滴加CCK-8液20 μL，孵育1 h，弃上清，酶标仪450 nm波长测定OD值。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.3 流式细胞仪分析细胞周期分布及凋亡对数生长期LOVO细胞以每孔1×105个数量接种于6孔培养板，培养24 h，分别加入0（对照组）、1.0、2.0、4.0 mg/L浓度的藤黄酸，继续培养24 h，离心获取细胞，PBS液洗涤，70%冷乙醇固定12 h，PBS液清洗去除固定液，离心获取细胞，RNA酶反应过夜，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色，488 nm激发波长，应用ModFit LT 2.0软件进行流式细胞仪分析。

1.2.4 Western Blot检测ANGPTL4蛋白表达分别收集0（对照组）、1.0、2.0、4.0 mg/L浓度藤黄酸处理24 h的LOVO细胞，蛋白裂解液提取蛋白，采用SDSPAGE方法进行电泳，每孔50 pg蛋白，100 V恒压电泳，转膜至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭2 h，滴加1∶500兔抗人ANGPTL4抗体，摇床振动摇匀2 h，PBST溶液洗涤3次，滴加1∶400兔抗羊IgG-HRP，摇床2 h，PBST洗涤3次，滴加ECL溶液进行显色、曝光、拍照、扫描，应用Image-Pro Plus软件分析蛋白灰度。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 藤黄酸对LOVO细胞生长和增殖作用

不同浓度藤黄酸作用于LOVO细胞后，呈现不同程度的抑制作用。藤黄酸浓度为0 mg/L（对照组）时，其对LOVO细胞基本无抑制作用，12、24、36 h后抑制率分别为（0.84±1.64）%、（0.98±1.04）%、（1.08±0.68）%；浓度为1.0 mg/L藤黄酸作用LOVO细胞12、24、36 h后抑制率分别为（8.43±1.62）%、（11.81±1.24）%、（29.30± 1.15）%，与对照组相比较，抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）；藤黄酸浓度为2.0 mg/L时抑制率分别为（36.74±1.38）%、（49.21±1.08）%、（85.35±1.26）%，与对照组相比较，抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）；藤黄酸浓度为4.0 mg/L时抑制率分别为（46.32±1.33）%、（77.92±1.10）%、（98.27±0.74）%，与对照组相比较，抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）。表明藤黄酸对LOVO细胞的生长和增殖具有抑制作用，该抑制作用随着藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长而增强，呈现浓度依赖性和时间依赖性。见图1。

2.2 藤黄酸对LOVO细胞细胞周期构成和凋亡水平的影响

藤黄酸干预LOVO细胞后，其细胞周期的构成发生显著改变。干预24 h后，藤黄酸浓度为1.0 mg/L时，G2/M期细胞分布较对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；藤黄酸浓度为2.0 mg/L时，G2/M期细胞分布较对照组明显增加，差异有高度统计学意义（P＜0.01），凋亡率较对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；藤黄酸浓度为4.0 mg/L时，（51.21±2.01）%的LOVO细胞阻滞于G2/M期，G2/M期细胞分布较对照组显著增加，G0/G1期细胞分布显著减少，两者比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01），凋亡率较对照组显著增加，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.3 藤黄酸对LOVO细胞ANGPTL4蛋白表达的影响

0、1.0、2.0、4.0 mg/L浓度藤黄酸分别处理LOVO细胞24 h后，相对分子量45 kD处见ANGPTL4蛋白条带逐渐变细，其灰度值分别为（812.00±3.04）、（640.00± 2.30）、（446.00±1.46）、（102.00±0.82）DPI。表明藤黄酸抑制LOVO细胞ANGPTL4蛋白表达，且随着藤黄酸浓度升高，ANGPTL4蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

3 讨论

结直肠癌是国内外最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，目前位居全球恶性肿瘤第3位[1-2]。术后复发转移是结直肠癌患者死亡的重要原因，是结直肠癌患者治疗的一大难题。结直肠癌发生、发展和侵袭转移机制仍未明确，其中，肿瘤微血管生成在该过程中有着重要意义[3]。

藤黄是治疗肿瘤的一种常见中药，其来源广，价格低，副作用少，藤黄酸是其活性成分。近年研究提示，藤黄酸具有多靶点的抗肿瘤作用，能通过多种机制来发挥作用。藤黄酸抗肿瘤作用与常见化疗药物不同，可以选择性杀死肿瘤细胞，而对人体正常细胞无明显的毒副作用。本课题组前期研究表明，藤黄酸能够通过抑制血管新生来抑制结直肠癌的生长和增殖[4-6]。

ANGPTL4是一种分泌蛋白，是血管生成素样蛋白家族成员之一，与血管生成、能量代谢及肿瘤生长和转移密切相关[7-8]。朱洪新等[9]研究发现，ANGPTL4能够通过促进细胞迁移及血管生成，促使胶质瘤C6细胞发生侵袭和转移。Le等[10]在肾细胞癌研究中发现，ANGPTL4 mRNA和蛋白表达增高。Nakayama等[11]发现，胃腺癌中ANGPTL4表达增加，表示ANGPTL4可能通过促进微血管生成，为肿瘤细胞提供丰富的血液供应，为肿瘤细胞的生长和增殖提供有利的环境和条件。该团队同时研究结直肠癌中ANGPTL4的表达情况，发现ANGPTL4表达增高并能够提高肿瘤的侵袭和转移能力[12]，但未进一步阐述相关作用机制。韩杰等[13]利用shRNA干扰大肠癌HT-29细胞，下调ANGPTL4的表达，发现癌细胞迁移能力受到抑制，提出其可能的机制：ANGPTL4相关信号通路活性降低，影响肌动蛋白快速聚合和解聚，从而抑制细胞的运动和迁移。Zhu等[14]研究认为，ANGPTL4的促肿瘤作用可能是通过诱导和增强由NADPH氧化酶介导的氧化还原反应，改变O2和H2O2之间的比例，为肿瘤细胞提供有利的环境和条件，提高肿瘤细胞活性，增强肿瘤细胞生长、增殖能力，促使肿瘤的进一步发展。

本实验结果显示，藤黄酸对结直肠癌LOVO细胞的生长和增殖具有抑制作用，该抑制作用随着藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长而增强，呈现浓度依赖性和时间依赖性。流式细胞仪检测结果显示，藤黄酸阻滞LOVO细胞于G2/M期，表示藤黄酸能够抑制LOVO细胞的DNA合成和有丝分裂[9]，从而抑制LOVO细胞的生长和增殖。随着藤黄酸作用浓度的升高，G2/M期阻滞比例升高，阻滞作用增强，表明藤黄酸对LOVO细胞周期的阻滞作用呈现浓度依赖性。此外，流式细胞仪结果还显示，高浓度藤黄酸能够诱导LOVO细胞的凋亡，浓度为1.0 mg/L时，LOVO细胞凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；浓度为2.0、4.0 mg/L时，凋亡率较对照组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。然而，LOVO细胞总体凋亡率较细胞周期阻滞程度低，提示藤黄酸抑制LOVO细胞生长增殖作用主要与细胞周期阻滞相关。

综上所述，藤黄酸能够抑制结直肠癌LOVO细胞的生长和增殖，促进LOVO细胞的凋亡，其作用机制可能是阻滞LOVO细胞于G2/M期，抑制LOVO细胞的DNA合成和有丝分裂，诱导细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞ANGPTL4蛋白的表达。藤黄酸是一种极具前景的抗癌药物，但其确切的作用机制仍需进一步深入研究和探讨。

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Effect of gambogic acid on colorectal cancer LOVO cell proliferation and ANGPTL4 expression

WEI JianchangCAO Jie▲YANG PingZENG ShanqiWANG ChengxingQIU XubinCHEN Huacui
Department of Gastrointestinal Surgery,Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangdong Province,Guangzhou510180,China

ObjectiveTo investigate the effect of gambogic acid on colorectal cancer LOVO cells proliferation and the expression of ANGPTL4,discuss the antitumor mechanism of gambogic acid.Methods LOVO cells were cultured with different concentrations of gambogic acid for 12,24 and 36 h in vitro.CCK-8 was used to observe the change in the proliferation of LOVO cells.Flow cytometry(FCM)was applied to analyze cell-cycle kinetics and apoptosis of LOVO cells cultured with different concentrations of gambogic acid for 24 h.Western Blot was applied to detect the protein expression of ANGPTL4.ResultsGambogic acid suppressed the proliferation of LOVO cells in a concentration-dependent and time-dependent manner(P＜0.05).Gambogic acid arrested LOVO cells at G2/M stages in a concentration-dependent manner(P＜0.05).Gambogic acid with high concerntration could induce apoptosis of LOVO cells(P＜0.05). Gambogic acid suppressed the expression of ANGPTL4 protein,the level of ANGPTL4 protein decreased as concentration increased（P＜0.05).ConclusionGambogic acid can inhibit the proliferation of LOVO cells,arrest LOVO cells at G2/M stages and induce apoptosis.The mechanism is related to the suppression of ANGPTL4.

Colorectal cancer;Gambogic acid;ANGPTL4

R735.35

A

1673-7210（2015）04（b）-0004-04

2015-01-03本文编辑：程铭）

国家自然科学资金资助项目（编号81272556）；广东省科技计划项目（编号2010B060900016）。

▲通讯作者