TG酶与单宁酸对鱼明胶凝胶强度的影响

潘军辉，王维亚，李 闯，刘子乐，张鹏*

(1.南昌大学食品学院，江西 南昌 330047；2.南昌市食品药品检验所南昌市食品安全检测与控制重点实验室，江西 南昌 330012)

明胶是胶原蛋白部分水解的产物，具有良好的生物可降解性和生物相容性，在食品、医药领域具有广泛的应用[1]。明胶主要从动物结缔组织的胶原蛋白中提取而来，但由于疯牛病、口蹄疫的影响，以及猪牛等动物来源明胶的宗教禁忌，传统动物明胶的应用受到了一定的限制。近年来，鱼明胶逐渐受到关注，相对于传统动物明胶，其来源广泛、价格便宜，且受众较多，具有极大的潜力替代现有动物来源明胶[2-6]，但由于它的凝胶强度、成膜性、乳化性等功能性性质略差[7]，在一定程度上限制其规模化应用。

目前主要通过明胶改性来提升明胶性质，常用的方法有物理法、化学法、酶法等[8-10]。物理改性是通过物理手段(γ射线、紫外线照射的光化学交联等)改变明胶自身凝胶网络结构，进而改善明胶原有的性能，该过程不需任何添加剂。化学改性是明胶链中的功能基团与小分子化合反应或明胶分子基团受到修饰，如利用自由基、离子与其发生加成或开环聚合反应，达到明胶改性的目的，常见的化学改性剂有醛类、天然酚类等。酶法改性是利用转谷氨酰胺酶(TG酶)、过氧化酶(POD)、酪氨酸酶等，催化明胶蛋白分子形成分子内或分子间交联。

单宁酸是一种常见的多酚，具有良好抗氧化性，也是一种天然的蛋白质交联剂和化学改性剂。邵士凤等[1,11]利用单宁酸对明胶进行改性处理，结果表明，单宁酸改性能显著提升明胶强度，降低凝胶的最低成胶浓度。单宁酸(non-oxidized tannic acid)在碱性条件下，其没食子酰基苯环上的羟基被氧化成醌，进而形成氧化型单宁酸(Oxidized tannic acid，OX-TA)，见图1。Anvari[12]等发现氧化型单宁酸和非氧化型单宁酸处理明胶-阿拉伯树胶聚集凝胶能在一定程度上改善明胶成胶性能和机械强度。目前单一方法制得的改性明胶对明胶的性质改善有限，有时并不能满足应用需求，研究者也倾向于综合运用多种方法实现明胶的改性[13]。因此，本文拟通过单宁酸和TG酶处理鱼明胶，以明胶质量的重要指标——凝胶强度为测定对象，验证单宁酸与TG酶对鱼明胶凝胶强度的影响，进而达到增强鱼明胶凝胶强度，减少明胶用量，降低鱼明胶使用成本，拓展其应用范围的目的。

图1 单宁酸的氧化

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

鱼明胶(食品级)上海鑫汐生物科技有限公司；谷氨酰胺转氨酶(50 U·g-1)江苏一鸣生物股份有限公司；单宁酸、冰乙酸、氢氧化钠均为分析纯上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

梅特勒-托利多台式酸度计(FE28型)梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；质构仪(TA-XTPlus)超技仪器有限公司；数显恒温水浴锅(HH-8型)金坛市城西晓阳电子仪器厂等。

1.3 实验方法

1.3.1 氧化型和非氧化型单宁酸母液的制备[12]

氧化型单宁酸溶液(新鲜配制)：取0.5 g单宁酸加入25 mL蒸馏水中混匀，用1 mol·L-1NaOH溶液调节pH至9.0，40 ℃水浴2 h，用50%冰乙酸回调至原pH，制成2%(m/V)的氧化型单宁酸母液。

非氧化型单宁酸溶液(新鲜配制)：取0.5 g单宁酸加入25 mL蒸馏水中混匀，制成2%(m/V)的非氧化型单宁酸母液。

50%冰乙酸溶液：取冰乙酸(C2H4O2)5 mL，加蒸馏水定容至10 mL。

1 mol·L-1NaOH：取40 g NaOH溶于蒸馏水中，最后定容至1 L。

1.3.2 单宁酸对鱼明胶凝胶强度的影响

取一定量鱼明胶加入42 mL蒸馏水中混匀，60 ℃水浴30 min，调整最终的明胶浓度分别为2%，4%，6%，8%，10%(m/V)。分别加入氧化型单宁酸和非氧化型单宁酸水溶液(2%，m/V)，使其最终体积浓度分别为0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%(V/V)，40 ℃水浴2 h。在4 ℃条件下成熟16～18 h，用TA-XTPlus型质构仪测量明胶的凝胶强度。

1.3.3 TG酶对不同浓度鱼明胶凝胶强度的影响

取一定量鱼明胶加入42 mL蒸馏水中混匀，60 ℃水浴30 min，调整最终的明胶浓度分别为：2%，4%，6%，8%，10%(m/V)。40 ℃水浴1 h，加入1 U·g-1TG酶，反应1 h，共水浴2 h，80 ℃水浴5 min灭活TG酶。在4 ℃条件下成熟16～18 h，用TA-XTPlus型质构仪测量明胶的凝胶强度。

1.3.4 TG酶处理时间对鱼明胶凝胶强度的影响

取鱼明胶2.52 g加入42 mL水中混匀制成6%(m/V)明胶溶液，60 ℃水浴30 min，加入1 U·g-1明胶质量的TG酶，40 ℃水浴，反应时间分别为0，15，30，60，90，120 min，40 ℃共水浴2 h，80 ℃水浴5 min使得TG酶失活。在4 ℃条件下成熟16～18 h，用TA-XTPlus型质构仪测量明胶的凝胶强度。

1.3.5 TG酶用量对鱼明胶凝胶强度的影响

取鱼明胶2.52 g加入42 mL水中混匀制成6%明胶溶液，60 ℃水浴30 min，分别加入0，0.5，1，1.5，2，2.5 U·g-1明胶质量的TG酶，40 ℃水浴1 h，加入TG酶反应1 h，80 ℃水浴5 min使TG酶失活。冷却后放入4 ℃层析柜16～18 h，用TA-XTPlus型质构仪测量明胶凝胶强度。

1.3.6 TG酶和单宁酸共同改性对鱼明胶凝胶强度的影响

取2.52 g鱼明胶加入42 mL水中混匀制成6%明胶溶液，60 ℃水浴30 min，分别加入氧化型单宁酸和非氧化型单宁酸母液(2%，m/V)，至其终体积浓度分别为0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%(V/V)，40 ℃水浴1 h，加入1 U·g-1明胶质量的TG酶，反应1 h，80 ℃水浴5 min使TG酶失活。冷却后放入4 ℃层析柜16～18 h，用TA-XTPlus型质构仪测量明胶凝胶强度。

1.3.7 明胶凝胶强度测定

用TA-XTPlus质构仪测定。设定条件为：柱塞P:0.5 R；下压4 mm，压力5 g，测前速度为2 mm·s-1，测试速度为速度1 mm·s-1，测后速度为2 mm·s-1。测试步骤：将样品在质构仪圆台上放平，柱塞对准胶面非中心下压，记录最大力。每一个待测样品测3次，作3个平行样，取平均值。

2 结果与分析

2.1 单宁酸对不同浓度鱼明胶凝胶强度影响

明胶浓度是影响明胶凝胶强度的重要因素。研究表明，明胶的凝胶强度会随着明胶浓度增大而增大，主要是因为明胶分子之间相互缠结，从而导致凝胶网络结构更加致密，网络结点数目也增多，分子间的作用力随之增强。单宁酸可与蛋白质中的氨基酸反应，在明胶溶液中加入单宁酸溶液会对明胶凝胶强度产生影响。我们在2%，4%，6%，8%，10%的鱼明胶中分别加入0.1%(V/V)的2%(m/V)的氧化型和非氧化型的单宁酸溶液，验证不同类型单宁酸对鱼明胶凝胶强度的影响。结果如图2所示。

明胶浓度/%

结果表明，随着鱼明胶浓度的增加，其凝胶强度也逐渐增强，加入单宁酸可以有效提升不同浓度下的鱼明胶凝胶强度，且相比于非氧化型单宁酸，添加氧化型单宁酸能更有效提升鱼明胶的凝胶强度。这可能是因为相比于非氧化性单宁酸，氧化型单宁酸与鱼明胶的相互作用除了非共价结合，还存在一定的共价结合，在一定程度上使氧化型单宁酸比非氧化性单宁酸更能提升鱼明胶的凝胶强度[14]。

2.2 不同浓度氧化型单宁酸对鱼明胶凝胶强度性质的影响

单宁酸可与明胶中的氨基酸基团进行反应，为了进一步验证氧化型单宁酸添加量对鱼明胶凝胶强度的影响。分别在2，4，6，8，10%(m/V)的鱼明胶中加入体积浓度为0%，0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%(V/V)的氧化型单宁酸母液(2%m/V)，测定其对鱼明胶凝胶强度的影响，结果如图3所示。

图3 不同浓度氧化型单宁酸对鱼明胶凝胶强度的影响

结果表明，鱼明胶凝胶强度受到氧化型单宁酸浓度的影响。氧化型单宁酸体积浓度从0%(V/V)增加到0.1%(V/V)时，鱼明胶凝胶强度随之快速上升；浓度超过0.1%(V/V)以后，鱼明胶凝胶强度变化趋于平稳，至浓度达到0.3%(V/V)后，鱼明胶凝胶强度开始下降。凝胶浓度为10%时，氧化型单宁酸对明胶凝胶强度的增幅比例开始下降，且在增加氧化型单宁酸浓度后，凝胶强度下降更快。这可能是因为随着鱼明胶浓度的增加，其凝胶网络变的更加紧密，单宁酸对明胶分子的交联效果变得有限，同时单宁酸分子与鱼明胶更容易形成聚合体，使凝胶网络不连续，进而引起鱼明胶凝胶强度的降低[15]。

2.3 TG酶对鱼明胶凝胶强度的影响

TG酶能够使得明胶蛋白形成分子内或分子间的共价交联，从而改善明胶凝胶的理化性质。在2%，4%，6%，8%，10%(m/V)的鱼明胶中，添加1 U·g-1明胶质量的TG酶，探讨TG酶对明胶凝胶强度的影响，结果如图4所示。TG酶的加入能显著提高鱼明胶的凝胶强度，当明胶浓度增加到6%时，TG酶对明胶的凝胶强度的提升比例达到最大，此后随着明胶浓度增加，TG酶处理对鱼明胶凝胶强度的提升效果开始减弱。

图4 TG酶对鱼明胶凝胶强度的影响

2.4 TG酶处理时间及浓度对鱼明胶凝胶强度的影响

为了进一步优化TG酶处理改性鱼明胶的条件，提升鱼明胶的凝胶强度，我们选择6%(m/V)的明胶出发，对TG酶处理时间(图5)和TG酶的添加量(图6)进行优化，验证其对鱼明胶凝胶强度的影响。结果表明，在6%明胶中，添加1 U·g-1明胶质量的TG酶后，在0～60 min内，鱼明胶凝胶强度随着TG酶处理时间的增加而增大，在反应60 min时，达到最大，60 min之后，鱼明胶的凝胶强度开始下降。而在6%明胶溶液中加入不同浓度的单宁酶后，鱼明胶的凝胶强度随着加入的TG酶浓度提升先上升，至TG酶浓度为1 U·g-1明胶质量时达到峰值，此后，随着TG酶添加浓度上升，鱼明胶的凝胶强度趋于平稳。

图5 TG酶反应时间对鱼明胶凝胶强度的影响

图6 TG酶添加浓度对鱼明胶凝胶强度的影响

TG酶催化明胶分子中谷氨酰胺的γ-氨基与赖氨酸ε-氨基发生交联，使得明胶蛋白形成分子内或分子间共价交联。鱼明胶在TG酶处理后，明胶形成更致密的网络结构，有利于明胶凝胶强度的提升，但是TG酶过度处理后，鱼明胶网络进一步交联，形成了粗壮的大孔网络，其凝胶强度开始下降[16]。

2.5 TG酶与单宁酸共同作用对鱼明胶凝胶强度的影响

在分别研究单宁酸和TG酶对鱼明胶凝胶强度影响的基础，进一步探究两者是否存在协同作用提升鱼明胶的凝胶强度。在明胶浓度为6%，添加1 U·g-1明胶质量条件下，加入不同体积浓度的氧化型单宁酸和非氧化型单宁酸母液。验证两者共同作用对鱼明胶凝胶强度的影响，结果如图7所示。

图7 TG酶与单宁酸共同作用对鱼明胶凝胶强度的影响

结果显示，用1 U·g-1TG酶和不同浓度的氧化型或非氧化型单宁酸处理6%(m/V)鱼明胶后，鱼明胶的凝胶强度随着单宁酸浓度的增加而先上升，至单宁酸母液体积浓度为0.2%(V/V)时达到最大值，此后随着单宁酸浓度进一步增加，鱼明胶的凝胶强度开始趋于下降。同时发现氧化型单宁酸与TG酶共同作用比非氧化型单宁酸与TG酶共同作用更有利于提升鱼明胶的凝胶强度。

在最优条件下，TG酶和单宁酸共同作用能有效提升约50%鱼明胶的凝胶强度，这一结果优于此前报道的单独TG酶、戊二醛交联、聚谷氨酸改性分别提升18.3、31.5、10.8%的明胶强度[10,17]，同时也优于本文单独优化的TG酶或单宁酸处理效果。其主要原因可能是两种方法有着不同的作用机制，能从多个方面综合提升鱼明胶的凝胶强度。

TG酶催化明胶分子中谷氨酰胺的γ-氨基与赖氨酸ε-氨基发生交联，使得明胶蛋白形成分子内或分子间共价交联；而单宁酸具有多个羟基，能增强明胶分子间的氢键和疏水作用；它们都能增加鱼明胶的凝胶强度[10,15]。两种改性方式之间并不存在明显的互斥，可以通过分子内、分子间的共价修饰及分子间氢键和疏水作用，共同作用进而增强鱼明胶的凝胶强度。

3 结论

本实验以酶法(谷氨酰胺转胺酶)和化学法(氧化型非氧化型单宁酸)改性鱼明胶，发现两种方法都能显著提升鱼明胶的凝胶强度，两种方法协同使用，能进一步提升鱼明胶的凝胶强度。其中氧化型单宁酸对明胶凝胶强度的提升明显优于非氧化型单宁酸。最优条件下，在6%明胶中，添加0.2%(V/V)的氧化型单宁酸后，鱼明胶凝胶强度最高为751.8 g；在6%明胶中，添加1 U·g-1明胶质量的TG酶后，鱼明胶凝胶强度最高为832.2 g；在6%明胶中，添加1 U·g-1明胶质量的TG酶和0.2%(V/V)的氧化型单宁酸后，鱼明胶凝胶强度最高为946.2 g。这一研究将有助于提升单位明胶的使用效率，节约明胶使用成本，为后续研究更多种辅料处理改性明胶提供了理论参考。同时也为更深入地研究和改善明胶的其它性质提供了思路。