姜黄素通过激活SIRT1抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化*

蔡 轶 吴 波 赵 莉 黄珺珺 刘夏雯 黄碧云 朱 柳

(1.广州医科大学药学院药物研发中心，广东 广州 511436； 2.广州医科大学蛇毒与生物毒素研究所，广东 广州 511436)



姜黄素通过激活SIRT1抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化*

蔡 轶1吴 波1赵 莉2黄珺珺1刘夏雯1黄碧云1朱 柳1

(1.广州医科大学药学院药物研发中心，广东 广州 511436； 2.广州医科大学蛇毒与生物毒素研究所，广东 广州 511436)

目的 研究姜黄素(Curcumin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌纤维化的影响，并观察其对SIRT1的调控。方法 心肌成纤维细胞给予Curcumin预处理后再给予AngⅡ刺激，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测成纤维细胞增殖水平，羟脯氨酸检测试剂盒检测成纤维细胞中羟脯氨酸的水平，Real-time PCR法检测collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、CTGF、FN等基因mRNA表达变化，Western Blotting和SIRT1酶活性检测试剂盒分别检测沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)的蛋白表达及去乙酰化酶活性的变化。结果 给予AngⅡ处理24 h后，细胞增殖水平增加、胶原合成相关基因表达增多、纤维化相关基因CTGF、FN的mRNA表达显著增加，并且SIRT1的蛋白水平和去乙酰化酶活性显著下降；Curcumin预处理可明显抑制Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖，抑制胶原合成以及纤维化相关基因CTGF、FN的表达，并增加SIRT1的蛋白水平和酶活性。结论 Curcumin可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞纤维化，其机制可能与SIRT1的激活有关。

姜黄素；心肌纤维化；增殖；SIRT1

心肌纤维化是指在心肌组织中胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著高于正常值，各型胶原比例失调或排列紊乱。临床上常见的心血管疾病如高血压性心脏病、缺血性心肌病、扩张性心肌病、病毒性心肌病和糖尿病心肌病等中均可观察到心肌纤维化的发生[1]。因此，预防和逆转心肌纤维化成为众多心血管疾病的主要治疗目标。

姜黄(Curcuma)是一种姜黄属植物的中草药，在印度、巴基斯坦和泰国被广泛用于食品加工，中医认为其有行风、散风活血、通经止痛的功效。姜黄素(Curcumin)是姜黄根茎中提取的一种黄色酸性酚类物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎及抑制肿瘤生长等多种药理活性[2]。近年来，Curcumin的心血管保护作用日益受到人们的关注，在急性冠脉综合症、动脉粥样硬化、心力衰竭等疾病中均有Curcumin作用研究的报道[3-4]。然而，Curcumin在心肌纤维化中的作用研究报道较少。本实验以心肌成纤维细胞作为主要研究对象，通过给予不同浓度Curcumin处理，观察其对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，并通过观察Curcumin对心肌成纤维细胞中沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)的影响初步探讨Curcumin抑制心肌纤维化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Curcumin(纯度>98%)购自阿拉丁公司，用DMSO配成20 mM储存液，并于-80℃保存；DMEM高糖培养基、新生牛血清、胰酶均购自Gibco BRL公司；AngⅡ购自Sigma-Aldrich公司，用无菌超纯水配成10-3M储存液，并于-80℃保存；Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所；SIRT1去乙酰化酶检测试剂盒购自日本Cyclex公司；SIRT1兔多抗、β-actin小鼠单抗以及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗均购自abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纤维细胞培养 取新生SD大鼠(出生1～3天)，用酒精消毒胸、腹部皮肤后，取出心脏放入预冷的PBS中，并剪成1 mm3的碎块。瞬时离心后弃上清。将心肌组织移入锥形瓶，加入15 ml 0.08%的胰酶37℃水浴消化5 min，收集细胞上清至含有15%胎牛血清的DMEM培养液中，1000 r/min离心5 min，重悬细胞沉淀，剩余组织继续消化，直到组织块消化完全为止。收集各次消化细胞悬液，1000 r/min离心8 min，用DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置培养箱中孵育1 h后，弃上清，再加入培养基于培养箱内常规培养。待长满后传代接种至所需的培养皿中，使用第2～4代心肌成纤维细胞。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 将心肌成纤维细胞接种于96孔板中，无血清处理后，采用20 μmol/L Curcumin预孵育1 h，再给予AngⅡ处理，每组设 6个平行孔，培养24 h后，每孔加入 10 μl CCK-8试剂， 继续于细胞培养箱内孵育1 h，450 nm波长处检测吸光度值A，计算细胞增殖。增殖率(%)=实验组OD450/对照组OD450×100%。

1.2.3 Real-time PCR检测mRNA表达 心肌成纤维细胞分别给予20 μmol/L Curcumin和AngⅡ处理处理24 h之后，弃培养基，采用Trizol一步法提取心肌成纤维细胞中的总RNA，RNA 定量后逆转录合成cDNA，用BIO-RAD荧光定量PCR系统进行实时荧光定量PCR反应。引物序列见表1。

1.2.4 Western Blotting检测蛋白表达 心肌成纤维细胞分别给予Curcumin和AngⅡ处理之后，弃培养基，加入三去污裂解液提取细胞总蛋白，依次进行 SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭，并加入待测一抗(SIRT1)和内参抗体(β-actin)，于4℃孵育过夜，次日加入相应的二抗，化学发光法检测目的蛋白表达水平，采用Image J软件对显影的条带进行灰度分析。

表1 引物序列

1.2.5 酶活性试剂盒检测SIRT1的活性 心肌成纤维细胞分别给予Curcumin和AngⅡ处理之后，弃培养基，裂解细胞、离心，收集上清。在细胞裂解液中加入1 μg SIRT1抗体，4℃慢摇2 h，加入15 μl protein G agrose beads，4℃慢摇过夜。离心、取上清，并用非变性裂解液反复洗涤3次，用cell lysis buffer将最终体积调整为15 μl，按照试剂盒说明书检测SIRT1的去乙酰化酶活性，利用Tecan多功能酶标仪检测荧光强度[激发光：(490±10) nm]；发射光：(530±10) nm]。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，各组数据以均值 ± 标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P≤0.05表明差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素对Ang II诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响 如图1所示，心肌成纤维细胞给予AngⅡ处理24 h之后，细胞增殖能力显著增加，采用20 μmol/L Curcumin预孵育1 h可显著抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖，而单独给予Curcumin对成纤维细胞增殖无明显作用。

图1 Curcumin对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响

2.2 Curcumin对心肌成纤维细胞胶原合成的影响 采用AngⅡ及20 μmol/L Curcumin处理心肌成纤维细胞之后，分别使用羟脯氨酸检测试剂盒及Real-time PCR的方法检测心肌成纤维细胞羟脯氨酸合成及collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ的表达水平。结果如图2所示，心肌成纤维细胞给予AngⅡ处理24 h后，羟脯氨酸合成增加，collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ的mRNA表达也显著增加，Curcumin预处理可显著抑制羟脯氨酸合成增加及collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ的mRNA表达水平的上升。

图2 Curcumin对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞胶原合成的影响(*P<0.05 vs. the group without treatment,#P<0.05 vs. the group treated with AngⅡ alone,n=3)

2.3 Curcumin对纤维化相关基因CTGF和FN表达的影响 为了进一步验证Curcumin对AngⅡ诱导的心肌纤维化的影响，分别检测了Curcumin对心肌成纤维细胞中CTGF和FN mRNA表达的影响。如图3所示，AngⅡ处理细胞24 h之后，CTGF和FN的mRNA表达均显著增加，Curcumin预处理可显著抑制AngⅡ诱导的CTGF和FN表达的增加。

图3 Curcumin对CTGF和FN表达的影响(*P<0.05 vs. the group without treatment,#P<0.05 vs. the group treated with AngⅡ alone,n=3)

2.4 Curcumin对心肌成纤维细胞SIRT1水平的影响 为了初步探讨Curcumin调控心肌纤维化的可能分子机制，我们检测了Curcumin对心肌成纤维细胞中SIRT1蛋白表达和组蛋白去乙酰化酶活性的影响，结果表明AngⅡ可下调SIRT1的蛋白表达和酶活性，而Curcumin预处理能够显著抑制AngⅡ诱导的SIRT1蛋白水平和酶活性的下降(图4)。

图4 Curcumin对心肌成纤维细胞SIRT1蛋白表达及酶活性的影响(*P<0.05 vs. the group without treatment,#P<0.05 vs. the group treated with AngⅡ alone,n=3)

3 讨 论

中药在心血管疾病中的作用越来越得到国际社会的承认，现有的研究认为中药具有化学结构和作用机制独特、多靶点、多途径、毒副作用轻等优点，探讨中药在心血管疾病中的作用是近年国内外研究的热点之一。Curcumin是目前世界上销量最大的天然实用色素之一，也是世界卫生组织和美国食品药品管理局以及多个国家认定的安全药物。基础及临床试验均证实，Curcumin在心血管疾病中具有重要作用。Curcumin可通过抑制黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，减少氧自由基的产生，还可以提高超氧岐化酶的活性，有效清除氧化物的作用，可能对心肌缺血起保护作用[5-6]。此外，Curcumin还通过促进肝和肾上腺对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)的代谢，增加胆囊对LDL-C排泄，抑制脾对LDL-C的摄取，使血中LDL-C和脂蛋白(a)的含量降低，从而具有降血脂和抗动脉粥样硬化作用[7-8]。Curcumin还可通过抑制p300-HAT的活性、阻断组蛋白乙酰化来预防和逆转主动脉环阻法和去氧肾上腺素灌注法诱导的大鼠心肌肥厚改善心肌重构[9]。然而迄今为止，Curcumin在心肌纤维化中的研究较少，值得进一步探讨。在本课题中，我们检测了不同浓度Curcumin对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞异常增殖及细胞外基质聚集的影响。结果发现，Curcumin可显著抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的增殖，并减少AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞胶原合成及纤维化相关基因CTGF和FN的mRNA表达。这些结果表明，Curcumin具有抗心肌纤维化作用，可能是一个潜在的防治心肌纤维化的药物。Curcumin调控心肌纤维化的具体分子机制至今尚未阐明。

沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)相关酶类是在研究酵母菌基因沉默时发现的一类高度保守的蛋白去乙酰化酶。目前发现，大部分物种中均存在Sir2同源基因，统称为sirtuins(SIRT)家族。在哺乳动物中共发现7种Sirtuins基因，分别命名为SIRT1-7[10]。其中，SIRT1与Sir2同源性最高。SIRT1主要通过对组蛋白及多种非组蛋白发挥去乙酰化作用，参与调节糖脂代谢、细胞周期调控、炎症、细胞衰老与凋亡等[11]。近年来，大量研究报道SIRT1在动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌纤维化等心血管疾病的发生发展中有重要调节作用[12-13]。在动脉粥样硬化斑块及衰老血管平滑肌细胞中，SIRT1表达降低，并且SIRT1敲除可减少平滑肌细胞中DNA修复并诱导衰老及凋亡，减少纤维帽厚度，降低斑块稳定性[14]。SIRT1在心肌缺血再灌注损伤中同样具有保护作用。研究表明，与正常小鼠相比，心肌特异SIRT1敲除小鼠心肌梗死面积显著增大，心肌特异SIRT1过表达小鼠心肌梗死面积及TUNEL染色阳性率较低；SIRT1的心肌保护作用与其对FOXO1活性、Bax和caspase-3表达的调节有关[15]。此外，Cappetta等[16]发现，激活SIRT1可通过下调TGF-β/smad3信号通路发挥抗心肌纤维化的作用。以上结果提示SIRT1在心血管疾病的发生发展过程中具有重要调控作用。在本课题中，我们检测了Curcumin对SIRT1蛋白表达和酶活性的影响，并发现AngⅡ可显著下调SIRT1的蛋白表达和去乙酰化酶活性，而Curcumin可显著改善AngⅡ诱导的SIRT1蛋白水平和酶活性的下降。提示SIRT1信号通路可能参与了Curcumin对心肌纤维化的保护作用。

综上所述，在本课题中我们证明Curcumin可抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化，并增加SIRT1的蛋白表达及去乙酰化酶活性。今后我们将进一步在整体动物水平明确Curcumin抑制心肌纤维化的作用，并探索Curcumin调控SIRT1的具体分子机制。本研究为将Curcumin应用于防治心肌纤维化临床实验提供了必要的数据。

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Curcumin inhibited AngⅡ-induced cardiac fibrosis by activating SIRT1

CAI Yi1WU Bo1ZHAO Li2Huang Jun-jun1LIU Xia-wen1HUANG Bi-yun1ZHU Liu1

(1.Pharmaceutical Research Center, Guangzhou 511436, China；2. Guangzhou Venom Research Institute, Guangzhou 511436, China)

Objective: To examine the effect of Curcumin on cardiac fibrosis induced by Ang Ⅱ, and elucidate the role of SIRT1. Methods: The cultured rat cardiac fibroblasts were preincubated with Curcumin for 1 h followed by treatment with 100 nmol/L AngⅡ for 24 h. The cell proliferation was determined by cell counting kit-8 (CCK-8) assays, the mRNA expression levels of collagen-Ⅰ, collagen-Ⅲ, CTGF, FN were detected by Real-time PCR, the protein expression and enzyme activity of SIRT1 were detected by Western blotting and fluorometric assay Kit respectively . Results: AngII-induced cardiac fibroblasts proliferation was inhibited by 20 μmol/L Curcumin. The mRNA expression of collagen-I, collagen-III, FN and CTGF were significantly upregulated by AngII which could be attenuated by Curcumin pretreatment. Moreover, the protein expression and enzyme activity of SIRT1 were downregulated after AngⅡ treatment, which could be reversed by Curcumin. Conclusion: Curcumin can inhibit AngⅡ-induced cardiac fibrosis by activating SIRT1.

Curcumin; myocardial fibrosis; proliferation; SIRT1

国家自然科学基金青年项目(81300085)，广州市科技计划-科学研究专项(201510010179)，广东省科技计划项目-广东省高科技发展专项项目(2013B010403024)。

蔡轶(1984—)，男，安徽合肥人，助理研究员，博士，研究方向：心血管药理学。

R969.4

A

1004-7115(2016)11-1201-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.11.001

2016-06-10)