牛跟腱胶原与草鱼皮胶原的结构表征及自组装行为比较

秦子波，余小月，乐薇，荣建华，熊善柏，胡杨，2，3，4＊

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学交叉科学研究院，湖北 武汉 430070；3.国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心（武汉），湖北 武汉 430070；4.华中农业大学深圳营养与健康研究院，湖北 武汉 430070）

引言

动物皮、跟腱等组织中富含I型胶原，是优良胶原的提取原料之一。I型胶原分子是由三条α螺旋链相互缠绕形成的右手超螺旋结构，在模拟生理条件下I型胶原分子可以通过分子间的相互作用组装成具有四分之一错位排列结构的胶原纤维[1-3]。这种高度有序的胶原纤维组装体由于具有适宜的理化特性、良好的生物诱导作用和低免疫原性，在皮肤、软骨、跟腱等组织修复材料领域日益受到重视[4]。据闫鸣艳[3]和Liu等人[5]报道，胶原的分子结构和氨基酸组成以及自组装条件（如温度、胶原浓度）会对胶原自组装行为产生显著影响。为探究不同来源的胶原在不同条件下自组装行为的差异，本文将以陆生和水生动物中两类来源最广泛的原料（牛源和鱼源胶原）为对象，综合运用圆二色谱（CD）、紫外光谱（UV）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）、氨基酸分析和动态流变等手段对牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的结构特性进行比较，并研究浓度和温度条件对两类胶原自组装行为的影响及组装动力学差异。本研究试图从分子结构差异-成纤维动力学-宏观流变学行为角度，阐明牛跟腱胶原与草鱼皮胶原的自组装行为差异，为牛跟腱胶原和草鱼皮胶原分子的组装行为调控及特性差异研究提供了一定的参考。

1 实验部分

1.1 主要材料与仪器

猪胃蛋白酶（400 u/mg），购于西格玛奥德里奇（美国）公司；乙酸、氢氧化钠、硫酸铵均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。FD-2A型真空冷冻干燥器，北京博医康实验仪器有限公司；低温恒温槽，北京市联华工业有限公司；J-1500型圆二色谱仪，日本佳司科公司；Nicolet470傅里叶变换红外光谱，美国尼高力公司；紫外分光光度计，日本岛津公司；L-8900型氨基酸分析仪，日本日立公司；DHR-2型流变仪，美国TA仪器公司；J-26XP型高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；Bio-Rad电泳仪，美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胶原提取方法

参考实验室方法提取牛跟腱胶原和草鱼皮胶原[6]。首先，将剪碎的牛跟腱和草鱼皮进行脱脂和除杂蛋白处理。随后，按照1∶50的料液比，将原料加入到含2%的胃蛋白酶（按干质量计）的0.5 mol/L醋酸中，在4℃条件下搅拌浸泡48 h，然后经离心、盐析、透析和冷冻干燥后得到牛跟腱胶原和草鱼皮胶原。

1.2.2 胶原性能表征

1.2.2.1 SDS-PAGE

取冻干后的胶原样品，用0.5 mol/L醋酸溶解，配制成5 mg/mL胶原溶液。采用12%浓缩胶和5%分离胶，上样量为15 μL。考马斯亮蓝R-250染色2 h，然后浸入脱色液中脱色至条带清析，背景接近无色，最后用凝胶自动成像仪扫描凝胶并保存图像。

1.2.2.2 UV分析

将胶原溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中，配制成0.1 mg/mL胶原溶液，在200～400 nm波长范围内对胶原进行紫外波长扫描，分辨率为0.2 nm。

1.2.2.3 FT-IR测定

冻干的胶原样品进行傅立叶变换红外光谱测试，波数范围为4000～700 cm-1，扫描次数为64次，分辨率为4 cm-1。

1.2.2.4 CD测定

用0.1 mol/L的醋酸配制成0.5 mg/mL的胶原溶液，在190～240 nm范围内、室温条件下进行波长扫描，比色皿光径为l nm，扫描速度为10 nm/min，间隔1 nm。

1.2.2.5 氨基酸组成分析

取胶原40 mg置于塑料离心管中，加入6 mol/L HCl，在110℃下水解24 h后，过滤,定容至25 mL，取1 mL滤液蒸干，随后加入1 mL的超纯水蒸干，重复进行两次，再加入1 mL 0.02 mol/L HCl溶解蒸干后的残留物，上样前过0.22 μm的水相滤膜。通过氨基酸半自动分析仪测定样品的氨基酸组分及其含量。

1.2.3 胶原自组装行为测试

1.2.3.1 胶原浓度对胶原自组装行为的影响

取不同质量浓度（1、1.2、1.5和2 mg/mL）牛跟腱胶原和草鱼皮胶原溶液，在4℃下调节pH至7.0，在37℃下置于313 nm处实时测定胶原的吸光度。

1.2.3.2 温度对胶原自组装行为的影响

取2 mg/mL的牛跟腱胶原和草鱼皮胶原溶液，在4℃条件下，调节pH至7.0，分别在25、37、42和50℃下，置于313 nm处实时测定胶原的吸光度。

1.2.3.3 自组装速率的计算

运用式（1）对胶原自组装生长期进行拟合，该阶段的斜率即为自组装速率。

At为时间t时的吸光度，Ae为自组装达到平衡时的吸光度，A0为初始吸光度，k是速率常数。

1.2.3.4 流变学性能测定

将自组装后的胶原凝胶置于平板直径为40 mm的流变仪中。设置频率范围为0.01～10 Hz，应变为2%，温度为37℃。记录样品存储模量（G'）和损耗模量（G''）。

2 结果分析

2.1 牛跟腱胶原与草鱼皮胶原结构特性的比较分析

两类胶原的SDS-PAGE如图1a所示，牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的电泳图谱相似，均包含α1链、α2链、β链和γ链。相对相对分子质量在130 ku附近的α1链电泳图谱强度约为α2链的两倍，与I型胶原的结构一致[7-8]。紫外光谱结果表明，牛跟腱胶原和草鱼皮胶原紫外扫描图谱基本相似，在230 nm处存在较强的吸收峰，这主要是由羰基C=O的n→π*跃迁所致（图1b）[9]。此外，两种胶原在280 nm处无明显的吸收峰，说明提取得到胶原中芳香族氨基酸含量较低，这与后续的氨基酸分析结果相一致。从图1c可以看出两类胶原的傅里叶变换红外图谱均存在I型胶原典型的5个特征酰胺带，牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的酰胺A带分别出现在3434 cm-1、3436 cm-1处，与草鱼皮胶原相比，牛跟腱胶原的酰胺A带发生了部分红移，这表明牛跟腱胶原分子中的部分基团参与形成了更多的分子间或分子内氢键[10]。此外，牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的酰胺B带分别出现在2931 cm-1和2934 cm-1处，这归因于CH2基团的不对称伸缩振动；酰胺I带分别出现在1650 cm-1和1654 cm-1处，主要与多肽链上C=O的伸缩振动有关[11]；酰胺II带出现在1552 cm-1处，由N-H弯曲振动和C-N拉伸振动产生[12]；酰胺III带出现在1241 cm-1附近，由C-N拉伸振动和N-H弯曲振动产生[13]。同时，两种胶原酰胺III带的峰值与1454 cm-1的峰值比近似为1.0，这表明两种胶原的三股螺旋结构保持完整[14-15]。圆二色谱结果表明，牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的负吸收峰均出现在199 nm处，正吸收峰分别出现在222 nm和221 nm处，且两者的RPN值（正负吸收峰比值的绝对值）分别为0.197和0.179，表明两类胶原均具有较为完整的三股螺旋结构，这与文献报道的结果相似（图1d）[16-17]。氨基酸结果表明（表1），两种胶原具有相似的氨基酸组成，甘氨酸（Gly）含量最高，占氨基酸总量的30%以上，其次为脯氨酸（Pro）与羟脯氨酸（Hyp），但同时发现，牛跟腱胶原的亚氨基酸（Pro+Hyp）的含量为25.4%，明显高于草鱼皮胶原的亚氨基酸含量（19.42%），而亚氨基酸分子中的吡咯环有利于稳定胶原的三螺旋结构，亚氨基酸含量越高，胶原稳定性越好[10，18]。

图1 牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的SDS-PAGE图（a）、UV图谱（b）、FT-IR图谱（c）和CD图（d）Fig.1 SDS-PAGE patterns(a),UV spectra(b),FT-IR spectra(c)and CD curves(d)of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen

表1 牛跟腱胶原和草鱼皮胶原氨基酸组成（%）Tab.1 Amino acid compositions of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen(%)

2.2 胶原浓度对胶原自组装性能的影响

胶原浓度对自组装行为的影响如图2（a、b）所示。可以看出，自组装过程分为三个阶段，分别为成核期、生长期和平衡期[19]。随着胶原浓度的增加，胶原的自组装进程加快，这表明提高胶原浓度能够加快胶原自组装进程[20]。当胶原质量浓度较低时（＜1 mg/mL），单位体积溶液中胶原分子数量较少且大多以游离形式存在，成核中心分子间的相互作用力较弱，导致组装过程中形成的胶原纤维数量较少；而当浓度增大时，体系中胶原的分子数量增多，从而有利于自组装的进行，尤其是当牛跟腱胶原质量浓度为2 mg/mL时，在120 s内胶原溶液的浊度值迅速上升至1.401，这与陈元昊[21]和闫鸣艳[22]等人的研究结果相似。图2（c、d）中t1/2是指自组装的半周期，半周期越短则胶原溶液自组装速率越大；△h是初始吸光值与平衡期吸光值之差。从图中可以看出，随着胶原浓度的增加，胶原自组装半周期（t1/2）缩短且△h变大，当胶原质量浓度由1 mg/mL升至2 mg/mL时，草鱼皮胶原的t1/2从230 s缩短至140 s，△h则从0.467升至0.992；而牛跟腱胶原的t1/2从210 s缩短至60 s；△h则从的0.521升至1.144。这说明增加胶原浓度能够加快胶原的自组装进程。

图2 (a)和(b)为不同浓度胶原的自组装浊度曲线（a为牛跟腱胶原、b为草鱼皮胶原），（c）和(d)为胶原自组装半周期（t1/2）及吸光度增加值（Δh)）（c为牛跟腱胶原、d为草鱼皮胶原）Fig.2 (a)and(b)represent the turbidity curves of collagen self-assembly at different concentrations(a:bovine achilles tendon collagen,b:grass carp skin collagen).(c)and(d)represent the half cycle of collagen self-assembly(t1/2)and the increase in absorbance(Δh)(c:bovine achilles tendon collagen,d:grass carp skin collagen)

2.3 胶原浓度对胶原自组装动力学的影响

为了探究不同胶原浓度对胶原自组装动力学的影响，运用式1对图2（a、b）浊度测定数据进行曲线拟合，得到相应的胶原自组装动力学拟合曲线（图3、图4）和胶原在生长期的自组装动力学参数（表2），其中k表示生长期的组装速率。

表2 不同质量浓度下牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的自组装参数Tab.2 Self-assembly parameters of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen at different mass concentrations

图3 不同质量浓度下牛跟腱胶原自组装动力学拟合曲线Fig. 3 Fitting curves of self-assembly kinetics of bovine achilles tendon collagen at different mass concentrations

图4 不同质量浓度下草鱼皮胶原自组装动力学拟合曲线Fig.4 Fitting curves of self-assembly kinetics of grass carp skin collagen at different mass concentrations

随着胶原浓度的增加，两种胶原的自组装速率呈现不断上升的趋势，当胶原质量浓度从1 mg/mL升至2 mg/mL时，草鱼皮胶原的自组装速率由0.15×10-4升至2.50×10-4，而牛跟腱胶原的自组装速率则从0.32×10-4升至3.01×10-4。此外，在胶原浓度相同的情况下，牛跟腱胶原的自组装速率要高于草鱼皮胶原，这表明了两种胶原在分子结构上的差异导致胶原自组装存在一定差异[23]。

2.4 温度对胶原自组装性能的影响

两种胶原在不同温度条件下的自组装行为变化情况，如图 5 所示。由图 5（a、b）可知，当温度为25 ℃时，草鱼皮胶原发生自组装，而牛跟腱胶原的自组装行为较差，吸光度变化较小。当温度升至37 ℃，两种胶原展现出高效的自组装行为，且平衡期的浊度显著升高，尤以牛跟腱胶原变化最为明显，其浊度值由25 ℃时的0.270 升至1.407，而草鱼皮胶原的浊度值由 25 ℃时的 1.175 升至1.337。当温度为42 ℃时，草鱼皮胶原开始变性，不具备自组装能力，而牛跟腱胶原虽具备自组装能力，但与37 ℃时相比其自组装性能开始下降，且平衡期的浊度值降至1.180。当温度达到50 ℃时，高温引起牛跟腱胶原变性，三螺旋结构解旋生成明胶，不具备自组装能力，其成核期吸光度的上升是由于传热不均导致的[24]。由于陆生和水生生物的最适生长环境以及亚氨基酸含量的不同，导致两种胶原在不同温度下的自组装性能出现差异。从图 5（c、d）中可以看出，在一定范围内随着温度的升高，胶原自组装半周期（t1/2）缩短且△h变大。当温度从25 ℃升至37 ℃时，草鱼皮胶原的t1/2从 360 s 缩短至140 s，△h则从 0.860 升至 0.992；而牛跟腱胶原的△h则从的0.137 升至1.144。这进一步说明了升高温度能够加快胶原的自组装进程[25]。

2.5 温度对胶原自组装动力学的影响

为了探究不同温度对胶原自组装动力学的影响，运用式（1）对图 5（a、b）浊度测定数据进行分析，得到自组装动力学拟合曲线（图6、图7）和胶原在生长期的自组装动力学参数（表 3），其中 k 表示生长期的组装速率。由表3 可知，当温度为37 ℃，牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的组装速率分别达 到 最 大 值 3.01 ×10-4和2.50×10-4，而当温度继续升高时，牛跟腱胶原的组装速率开始下降，草鱼皮胶原发生变性，不具备自组装能力，未获得自组装速率常数。当温度达到50 ℃时，未得到牛跟腱胶原的速率常数，说明牛跟腱胶原发生变性，也不再具有自组装的能力。因此，适度提高温度有助于胶原的自组装，但温度过高时会导致胶原变性，使胶原无法进行自组装。金达丽的研究也表明在一定范围内提高温度对胶原自组装有促进作用[26]。

图5 (a)和(b)为不同温度胶原的自组装浊度曲线（a 为牛跟腱胶原、b 为草鱼皮胶原），(c)和(d)为胶原自组装半周期(t1/2)及吸光度增加值(Δh)(c 为牛跟腱胶原、d 为草鱼皮胶原)Fig. 5 (a)and(b)represent the turbidity curves of collagen self-assembly at different temperatures(a:bovine achilles tendon collagen,b:grass carp skin collagen).(c)and(d)represent the half cycle of collagen selfassembly(t1/2)and the increase in absorbance(Δh)(c:bovine achilles tendon collagen,d:grass carp skin collagen)

图6 不同温度下牛跟腱胶原自组装动力学拟合曲线Fig. 6 Fitting curves of self-assembly kinetics of bovine achilles tendon collagen at different temperatures

图7 不同温度下草鱼皮胶原自组装动力学拟合曲线Fig. 7 Fitting curves of self-assembly kinetics of grass carp skin collagen at different temperatures

表3 不同温度下牛跟腱胶原和草鱼皮胶原的自组装参数Tab. 3 Self-assembly parameters of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen at different temperatures

2.6 动态频率扫描

图8 为不同质量浓度（1.5 mg/mL 和 2 mg/mL）下牛跟腱胶原和草鱼皮胶原在37 ℃下组装成凝胶后的动态扫描曲线图。在相同的浓度条件下，两类胶原的存储模量均高于其损耗模量，表明胶原分子组装形成的凝胶具有明显的弹性特征。在质量浓度为1.5 mg/mL 时，牛跟腱胶原的弹性模量从0.98 Pa 快速上升至4.76 Pa，草鱼皮胶原则从1 Pa 上升至4.1 Pa，牛跟腱胶原在同样的频率下其弹性模量大部分高于鱼胶原，在质量浓度为2 mg/mL时也发现了类似的现象，这可能是因为牛胶原中的亚氨基酸含量（Pro+Hyp）要高于草鱼皮胶原，导致胶原组装成凝胶的过程中其刚性较强[27]，该结果也与前文中氨基酸组成的差异相一致。

图8 不同质量浓度下（1.5 mg/mL 和2 mg/mL）牛跟腱胶原和草鱼皮胶原在37 ℃下组装成凝胶后的动态扫描曲线图（G'为存储模量，G''为损耗模量）Fig. 8 The dynamic scan profiles of bovine achilles tendon collagen hydrogel and grass carp skin collagen hydrogel assembled at 37 ℃at different mass concentrations(1.5 mg/mL and 2 mg/mL) (G' is the storage modulus and G'' is the loss modulus)

3 结论

采用“酸-酶”结合法制备了具有良好三股螺旋结构的牛跟腱胶原和草鱼皮胶原，两类胶原具有类似的光谱学特征和二级结构，但其氨基酸组成存在一定差异，牛跟腱胶原的亚氨基酸（Pro+Hyp）含量比草鱼皮胶原高约6%。胶原浓度和环境温度对其自组装行为有较大影响，随着浓度增加，胶原自组装进程加快，自组装后凝胶的动态粘弹性升高。此外，在相同浓度下牛跟腱胶原的自组装速率高于草鱼皮胶原，且自组装后胶原凝胶的动态粘弹性较高。同时，在一定温度范围内，升高温度对胶原自组装有促进作用，而过高或过低的温度都会对胶原自组装产生不良影响。当温度为25 ℃时，牛跟腱胶原未进行自组装，而草鱼皮胶原可以进行自组装，当温度升至37 ℃时，两种胶原都展现出高效的自组装行为。而当温度继续升高时，胶原会发生变性，牛跟腱胶原的热稳定性更高，这与其亚氨基酸组成密切相关，整体而言，牛跟腱胶原的自组装效果优于草鱼皮胶原。