藏猪和杜洛克猪CAPN3基因表达差异及其与肉质性状相关性分析

陶璇，顾以韧，梁艳，杨雪梅，钟志君，陈晓晖，杨跃奎，曾凯，吕学斌

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都610066）

藏猪和杜洛克猪CAPN3基因表达差异及其与肉质性状相关性分析

陶璇1，2，顾以韧1，2，梁艳1，2，杨雪梅1，2，钟志君1，2，陈晓晖1，2，杨跃奎1，2，曾凯1，2，吕学斌1，2

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都610066）

为了揭示脂肪型的藏猪和瘦肉型的杜洛克猪肌肉生长及嫩度相关基因的表达差异，采用QRT-PCR方法检测了两猪种背最长肌中钙蛋白酶3（CAPN3）基因在180日龄的表达差异，分析其表达与肌纤维面积（CSA）、肌肉剪切力的相关性。结果表明，180日龄藏猪CAPN3 mRNA表达量显著高于杜洛克猪（P＜0.05）。相关性分析结果显示，CAPN3 mRNA表达量与肌纤维面积、剪切力均呈显著负相关（P＜0.05）。以上结果初步揭示了两猪种在180日龄CAPN3基因表达的品种差异，为深入研究猪肌肉生长及剪切力的调控机制提供了基础数据。

猪；背最长肌；荧光定量PCR；CAPN3基因；肌纤维面积；剪切力

钙蛋白酶（Calpain,CAPN）是一种存在于细胞内的非溶酶体性的限制性蛋白水解酶，与肉的嫩度和风味等食用品质密切相关[1]，是理想的肉质嫩度分子标记[2]。Calpain3（CAPN3或P94）基因作为影响肉嫩度的候选基因，其分子生物学特性和生理调控功能是近年来研究的热点之一。CAPN3是最典型的组织特异性钙蛋白酶，只在骨骼肌中特异表达，且在骨骼肌细胞中其mRNA表达量是经典钙蛋白酶的10倍，呈现高度表达[3]，与肌肉发育之间存在着密切关系[4]。目前关于CAPN3基因的研究，主要集中在CAPN3基因的克隆、多态性分析以及与鸡、鸭、猪、牛及羊等物种肉质及胴体重相关性的探讨上。Ilian等的研究揭示了CAPN3的mRNA水平[5]和蛋白质水平[6]与肉嫩度之间存在着强相关。侯冠彧等[7]对CAPN3基因的5'区域进行SNP检测和基因型分析，初步断定该基因本座位有影响肉牛生长及牛肉嫩度的倾向。Felicio等[8]进一步证实该基因多态性与鸡腿肌重、烹饪损失及剪切力密切相关。鸭骨骼肌发育过程中，CAPN3基因与肌纤维类型和肌纤维的生长发育密切相关，其变异影响肉的品质[9]。对猪CAPN3的研究包括CAPN3基因的克隆及多态性检测，但没有与肉质性状相关的报道[10-11]。本研究以选育程度低、瘦肉率低的藏猪和选育程度高、瘦肉率高的杜洛克猪为研究对象，采用荧光定量PCR（QRTPCR）方法研究两猪种180日龄时背最长肌中CAPN3 mRNA的表达差异及其与肉质性状的关系，为研究CAPN3基因影响肌肉生长及剪切力的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及采样

试验采用的藏猪、杜洛克猪均由四川省畜牧科学研究院科研实验猪场提供。于2014年5月随机挑选35日龄断奶的藏猪、杜洛克猪各4头，共计8头组建群体，采用相同营养水平和饲喂方式，到180日龄时进行屠宰，屠宰前停食24 h，自由饮水。采集倒数3～4肋骨间对应处的背最长肌样品及最后肋骨向后8～10 cm完整背最长肌，一部分用于肌纤维面积、剪切力测定，另一部分浸泡于RNA later（Qiagen公司）中，随后投入液氮中保存。

1.2 肉质性状测定

1.2.1 肌纤维面积测定采用KD-2508型切片机（Kedee公司）按照冰冻切片标准制作流程制作背最长肌样品的冰冻切片，苏木精-伊红（Hematoxylin&eosin,H&E）染色后用BK 5000型显微成相系统（Optec公司）采集代表性区域图像，通过Motic Images Advanced 3.2显微图像分析软件计算每个样品中100根肌纤维的面积。

1.2.2 剪切力测定屠宰后采集最后肋骨向后8～10 cm完整背最长肌，4℃冷藏熟化，48 h后取出装入自封袋中，放入已设置水浴终止温度为70℃的恒温水浴锅，待加热至肉样中心温度为70℃时取出，剔除肌肉表面的膜、筋、腱和脂肪等，用肉样取样器取出肉样（直径1 cm），在CT3质构仪（Brookfield，美国）上测定样品的剪切力，每个样品做5个重复，取剪切力曲线相近3个测定值的平均值。

1.3 QRT-PCR测定CAPN3 mRNA相对表达量

1.3.1 总RNA提取和反转录肌肉样品的总RNA提取按照mirVana Kit（Life Technologies Corporation, USA）试剂盒的操作说明书完成，并通过Agilent Bioanalyzer 2100对抽提的RNA进行质检，然后使用SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）进行cDNA的合成。

1.3.2 PCR引物的设计与合成引物由Primer premier 5.0程序设计，深圳华大基因科技有限公司合成，信息见表1。

表1 荧光定量RT-PCR目的基因引物的相关信息

1.3.3 QRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）仪器上进行mRNA荧光定量PCR检测。PCR反应体系为25 μL：12.5 μL SYBR Green q-PCR Super Mix，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL的cDNA模板，RNAase free水9.5 μL。采用两步法进行荧光定量PCR的扩增。PCR循环参数为：95.0℃10 s；95.0℃5 s，60℃30 s，循环40次，PCR扩增后进行熔解曲线分析，温度以0.5℃/30 s的速率从55.0℃缓慢递增到95.0℃。试验样本和阴性对照每个样本重复3次。

1.4 统计分析

选用肌肉组织中稳定表达的ACTB、TBP和TOP2B为看家基因，运用GeNorm软件计算出看家基因的归一化因子NF值（Normalization factor），以目的基因mRNA的拷贝数（最大拷贝数设为1）与对应样品的NF值的比值表示基因mRNA的相对表达量[12]。采用SigmaPlot 12.5软件对性状指标和基因相对表达量进行t检验，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 肌纤维面积、剪切力测定

由表2可知，180日龄藏猪、杜洛克猪的肌纤维面积分别为2 221.52 μm2、6 351.41 μm2，剪切力分别为3 581.25 g、6 548.25 g。藏猪肌纤维面积、剪切力均极显著小于杜洛克猪（P＜0.01）。

表2 180日龄藏猪、杜洛克猪的肌纤维面积、剪切力

2.2 CAPN3 mRNA表达量及其与肌纤维面积、剪切力相关性分析

由图1可知，180日龄藏猪CAPN3 mRNA表达量显著高于杜洛克猪（P＜0.05）。对CAPN3 mRNA表达量与肉质性状肌纤维面积、剪切力的相关性进行分析，结果见表3。由表3可知，CAPN3 mRNA表达量与肌纤维面积、剪切力均呈显著负相关（P＜0.05）。

图1 180日龄藏猪与杜洛克猪CAPN3基因相对表达量

表3 CAPN3 mRNA表达量与肌纤维面积、剪切力相关性分析

3 讨论

影响肉嫩度的因素有许多，包括肌纤维直径、密度和类型，结缔组织含量及组成，蛋白水解酶的含量及活性，肌糖原及肌内脂肪的含量，游离钙离子浓度等。在这些因素中，Calpain的含量及活性是影响动物屠宰后肉嫩化的主要因素。在正常生理条件下，Calpain主要在细胞质中以无活性的状态存在，动物屠宰后，肌细胞内储存的钙离子（Ca2+）从内质网小泡中释放出来，使得细胞质中Ca2+浓度升高，Calpain被激活，从细胞质转移至细胞膜或细胞器膜上，通过自溶降解肌联蛋白和伴肌动蛋白，促进肉的嫩化[13]。

藏猪是国家级畜禽资源保护猪种，肌纤维细，肉质优良，而杜洛克猪肌纤维较粗，肉质较差。本研究结果显示，同月龄藏猪肌纤维面积、肌肉剪切力均极显著低于杜洛克猪（P＜0.01），这与藏猪和杜洛克猪的种质特性相一致。此外，180日龄藏猪CAPN3 mRNA表达量显著高于杜洛克猪（P＜0.05），与肌纤维面积、剪切力均呈显著负相关（P＜0.05），这与Showalter等[4]及Ilian等[5]研究结果一致，说明CAPN3基因会抑制肌纤维生长，同时在猪屠宰后促进肉的嫩化。

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[5]Ilian M A,Morton J D,Kentm P,et al.Intermuscular variation in tenderness:Association with the ubiquitous and muscle specific calpain[J].Journal of Animal Science,2001,79(1):122-132.

[6]Ilian M A,Morton J D,Bekhit A E,et al.Effect of preslaughter feed withdrawal period on longissimus tenderness and the express of calpains in the ovine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(4):1990-1998.

[7]侯冠彧，曾鸿普，王东劲，等.钙蛋白酶3（CAPN3）基因多态性与牛胴体性状的关联分析[J].畜牧兽医学报，2010，41（4）：398-402.

[8]Felicio A M,Boschiero C,Balieiro J C,et al.Identification and association of polymorphisms in CAPN1 and CAPN3 candidate genes related to performance an meat quality traits in chickens[J].Genetic and Molecular Research,2013,12(1):472-482.

[9]朱文奇，徐文娟，束婧婷，等.鸭骨骼肌早期发育过程中钙蛋白酶3（CAPN3）基因的表达及其与肌纤维性状的关联[J].畜牧兽医学报，2014，45（3）：385-390.

[10]邢明伟，孙丽华，刘娣.猪CAPN3基因的克隆及PCR-SSCP分析[J].黑龙江畜牧兽医，2010（1）：29-30.

[11]杨秀芹.家猪、野猪CAPN家族4个基因的克隆、表达模式和多态性研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2007.

[12]Erkens T,Poucke M V,Vandesompele J,et al.Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RTPCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle,and evaluation with PPARGC1A[J].Bmc Biotechnology,2006,6(1):41.

[13]Ilian M A,Bekhit A E D,Stevenson B,et al.Up and down regulationof longissimus tenderness parallels changes in the myofibril boundcalpain 3 protein[J].Meat Science,2004,67 (5):433-455.

（编辑：富春妮）

绿色环境有益女性长寿

据美国《环境健康展望》杂志刊登哈佛大学一项新研究发现，居住环境绿植多可显著降低女性死亡率。与生活在绿植最少环境的女性相比，生活在绿植最多环境的女性死亡率可降低12%。

新研究中，哈佛大学陈曾熙公共卫生学院流行病学专家彼得·詹姆斯博士和布莱根妇女医院专家对美国护士健康研究（2000—2008）涉及的108 630名女性的相关数据展开了梳理分析。研究人员对参试女性的死亡风险与其居住环境绿植水平进行了对比分析。新研究还考虑了年龄、社会经济地位、种族及抽烟等其他死亡风险因素。结果发现，高绿植居住环境与低死亡率之间关联性在呼吸道疾病和癌症死亡率方面体现最明显。与生活在低绿植居住环境的女性相比，生活在高绿植居住环境的女性呼吸道疾病死亡率降低34%，癌症死亡率降低13%。

詹姆斯博士分析指出，最新研究结果与环保领域的一些建议是一致的。比如，绿色植物可减少空气污染，降低噪音，改善环境，增加运动机会等等。这些都有益身体健康。

（转自《中国中医药报》2016-04-28陈希/文）

Expression Differences of CAPN3 Gene and Its Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Tibet and Duroc Pigs

TAO Xuan1，2,GU Yiren1，2,LIANG Yan1，2,YANG Xuemei1，2,ZHONG Zhijun1，2, CHEN Xiaohui1，2,YANG Yuekui1，2,ZENG Kai1，2,LV Xuebin1，2
(1.Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China;2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610066,China)

To investigate the differential expression of Calpain3(CAPN3)gene between Tibet(a fatty, indigenous,Chinese breed)and Duroc(a leaner,Western breed)pigs.The expression differences of CAPN3 gene in longissimus dorsi muscle were measured in two pig breeds at the age of 180 days by using QRT-PCR approach,their correlations withcross sectional area of muscle fiber(CSA)and shear stress were also analyzed.The results showed that theexpression level of CAPN3 mRNA in Tibet pigs was significantlyhigher than that of Duroc pigs at the age of 180 days(P＜0.05).The correlation analysis results showed that theexpression level of CAPN3 mRNA had significant negative correlation with CSA and shear stress(P＜0.05).These results suggested that the mRNA level of CAPN3 gene in longissimus dorsi muscle are different in Tibet and Duroc pigs at the age of 180 days,which provided some data for further study on elucidating the molecular mechanism of growth of muscle fibers and shear stress.

pig;longissimus dorsi muscle;QRT-PCR;CAPN3 gene;cross sectional area of muscle fiber;shear stress

S828.8

A

1002-1957(2016)04-0076-03

2016-06-22

国家生猪产业技术体系-综合试验站（CARS-36）；四川省科技支撑计划（2014NZ0092）；国家现代农业产业技术体系四川创新团队（sccxtd-001）；四川省财政运行专项（SASA2014 CZYX001）；四川省基本科研业务费专项资金（SASA2014A04）；四川省基本科研业务费专项资金（SASA2013B02）

陶璇（1982-），男，四川金堂人，助理研究员，硕士，主要从事猪遗传育种与繁殖研究工作.E-mail:taoxuan0106＠163.com

吕学斌（1965-），男，研究员，博士，主要从事猪遗传育种研究工作.E-mail:lvxuebin＠21cn.com