3种商品稀释剂对关中黑猪精液常温保存效果的研究

刘兆军，谢景兴，侯震坤，魏宁，杨公社，庞卫军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

3种商品稀释剂对关中黑猪精液常温保存效果的研究

刘兆军，谢景兴，侯震坤，魏宁，杨公社，庞卫军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

研究通过检测精子活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体膜完整率来评价3种商品稀释剂对关中黑猪精液保存的效果。结果表明，日本某稀释剂对关中黑猪精液常温保存效果要显著优于比利时以及英国某稀释剂（P＜0.05），保存至第5天时日本某稀释剂组的精子活率仍达到0.75，大于比利时某稀释剂组的0.53和英国某稀释剂组的0.51。此外，保存至第5天精子活率、顶体完整率、线粒体膜完整率保存效果上，比利时某稀释剂组和英国某稀释剂组较为相近，而在对质膜完整率的保存效果上，英国某稀释剂组要显著优于比利时某稀释剂组（P＜0.05），保存至第5天时质膜完整率英国某稀释剂组和比利时某稀释剂组分别为44.52%和32.48%。

关中黑猪；猪精液；商品稀释剂；常温保存

关中黑猪是陕西省家畜育种专家培育的肉脂兼用型品种，具有抗病力强、繁殖力高、耐粗饲等特点。由巴克夏猪、甘肃泾川八眉猪、四川内江猪于20世纪70年代杂交繁育而成，并于20世纪80年代初完成鉴定获得农业部首批地理标志产品品种。目前，关中黑猪养殖现状处于保种状态[1]。随着人们消费观念的改变，关中黑猪肉将可能成为人们青睐的商品猪肉。人工授精技术是关中黑猪产业化的必然选择，猪精液稀释剂是进行人工授精技术的关键之一，所以选择适宜的精液稀释剂对关中黑猪的人工授精技术推广十分重要。目前，市场上销售的商品稀释粉种类繁多，且在地方品种或者培育品种精液常温保存的研究报道不多。因此，选择适宜关中黑猪精液的稀释剂将有利于关中黑猪人工授精技术的推广，并将促进关中黑猪产业化进程。

本试验选取市售日本某稀释剂、比利时某稀释剂以及英国某稀释剂，通过检测精子活率、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜完整性等指标对比3种稀释剂对关中黑猪精液的常温保存效果，比较不同商品稀释剂的优劣，为关中黑猪人工授精技术的推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验选取西北农林科技大学畜牧教学试验基地的3头10月龄关中黑猪种公猪作为精液来源动物。3头公猪性成熟且发育良好，均按照相同的常规饲养方式进行单栏饲养。

1.2 主要试剂和仪器

pH试纸，市售日本某稀释剂、比利时某稀释剂以及英国某稀释剂，双蒸水，75%酒精，精子快速染液，Rh123（罗丹明123），PI（碘化丙啶），果糖-柠檬酸钠低渗溶液。

Ibersan v11型精子密度仪、温度计、普通光学显微镜、荧光显微镜，康佳BC-50MN 17℃恒温冰箱、恒温水浴锅、37℃恒温电热板、移液枪、镊子、滴管、玻璃棒等。

1.3 精液采集与处理

1.3.1 精液采集采用双层手套手握法采精，用带有4层过滤纱布和保温杯收集富精子部分的精液。

1.3.2 检测原精品质手握法采集种公猪浓精部分并用4层医用纱布过滤后，在保温杯中保存，立即到实验室进行镜检，将精液用玻璃棒置于37℃恒温载物台上，观察精子活力，稀释后并计算其密度。选择精子活率在0.70以上，色泽、气味正常的精液用于后续试验。

1.3.3 精液稀释、分装及保存精液稀释前2 h，将3种稀释剂置于37℃的水浴锅中升温备用，将检测合格的精液分成3组，Ⅰ组采用日本某稀释剂、Ⅱ组采用比利时某稀释剂、Ⅲ组采用英国某稀释剂，均按照1∶2的比例缓慢将等温稀释剂沿容器壁缓慢加入精液中，轻轻摇晃混匀。混匀后将稀释后的猪精液分装到提前预热到37℃的50 mL离心管中，然后用4层毛巾包裹缓慢降温，室温放置2 h后连同毛巾一起放入17℃恒温保存箱中保存，每隔12 h轻轻摇动精液1次。每隔24 h检测精子各项指标，直至精子活力低于0.60。

1.4 检测指标

1.4.1 精子活率采用10级制，在显微镜视野中估算直线前进运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级，90%者为0.9级，以此类推。

1.4.2 精子质膜完整性分别从6个锥形瓶中用移液枪吸取精液0.1 mL加入装有1 mL果糖-柠檬酸钠低渗溶液的试管中混匀，37℃水浴30 min后取出，室温静置1 min，吸取滴片10 μL，用高倍镜（400×）镜检，每次至少记录200个精子中弯尾的精子数量，计算精子质膜完整率。

1.4.3 精子顶体完整性使用南京建成科技有限公司生产的精子快速染色液，试剂盒采用世界卫生组织（WHO）推荐的快速改良巴氏染色法，适用于精子形态检查等。按照试剂盒说明书进行操作染色，最后在显微镜油镜下观察计数，并计算精子顶体完整性。

1.4.4 精子线粒体膜完整性使用Rh123和PI对精子进行联合染色后，在荧光显微镜下观察精子发光情况：1）精子头部核区发出红色荧光：死精子；2）精子发出绿色荧光：线粒体膜功能良好的精子；3）精子同时发出两种荧光：处于将要死亡的过渡状态的精子。精子线粒体膜完整率=线粒体膜完整精子数/计数精子总数×100%。

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1.5 统计分析

试验所得数据经Excel 2013初步整理后，采用SPSS 18.0统计软件进行分析，结果以平均值±标准误表示，用One-way ANOVA进行方差分析与显著性检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 关中黑猪鲜精品质

经测定，关中黑猪精液品质的各项指标均符合国家标准，详见表1。

表1 关中黑猪精液品质鉴定结果

2.2 不同稀释剂对关中黑猪精子活率的影响

由表2可知，3种稀释剂保存效果最好的是Ⅰ组，当保存时间达5 d时精子活率仍然维持在0.7以上，显著好于Ⅱ组和Ⅲ组（P＜0.05）。3种稀释剂在第1天对精子保存的效果差异不明显（P＞0.05），但从第2天开始，Ⅰ组保存效果要明显优于Ⅱ组和Ⅲ组，而Ⅱ组和Ⅲ组的保存效果差异不显著（P＞0.05）。

表2 3种稀释剂对关中黑猪精子活率的影响

2.3 不同稀释剂对关中黑猪精子质膜完整率的影响

由表3可知，在所选用的几种稀释剂中，对关中黑猪质膜完整性的保存效果最好的是Ⅰ组，其次为Ⅲ组，最差为Ⅱ组。在第1天和第2天时，Ⅱ组、Ⅲ组保存效果差异不显著（P＞0.05），但从第3天开始，Ⅲ组保存效果要显著优于Ⅱ组（P＜0.05）。

2.4 不同稀释剂对关中黑猪精子顶体完整率的影响

由表4可知，Ⅰ组对关中黑猪精子顶体完整性的保存效果好于其他两组。第1天和第2天时，Ⅰ组、Ⅱ组保存效果差异不明显（P＞0.05）；从第3天开始，Ⅰ组保存效果要显著优于Ⅱ组、Ⅲ组（P＜0.05），而Ⅱ组、Ⅲ组差异不显著（P＞0.05）。

表3 3种稀释剂对关中黑猪精子质膜完整率的影响

表4 3种稀释剂对关中黑猪精子顶体完整率的影响

2.5 不同稀释剂对关中黑猪精子线粒体膜完整率的影响

由表5可知，Ⅰ组对关中黑猪精子线粒体膜完整性的保存效果显著好于其他两组（P＜0.05），Ⅱ组和Ⅲ组差异不显著（保存第3天精子线粒体膜完整率除外）。

表5 3种稀释剂对关中黑猪精子线粒体膜完整率的影响

3 讨论

目前，由于国外优良瘦肉型猪种对国内养猪业的巨大影响，我国许多地方品种和培育品种的养殖均受到不同程度的冲击。由于养殖规模小，诸如梅山猪等地方品种和关中黑猪等培育品种基本处于保种和本交状态。但随着消费者态度的转变，为促进关中黑猪等猪种的产业化进程，人工授精技术的普及不可或缺，对于该猪种常温保存稀释剂的选择显得尤为重要。陈晓畅等设计了5种稀释剂配方对关中黑猪精液在17℃的保存效果试验，筛选出最佳自配稀释液[2]。本试验选取市售的3种常见稀释剂，对关中黑猪精液进行保存，根据保存效果判定筛选出最佳稀释剂为日本某稀释剂，这为后续关中黑猪的猪精液常温保存和人工授精提供参考。邢军等参考经典配方Androhep、choffow和葡-柠-EDTA并略作完善，应用于梅山猪精液17℃常温保存，发现葡-柠-EDTA液保存的猪精子活率显著低于前两种稀释液的保存效果[3]。此外，马红等、李玉芳等、邢军等还分别对民猪、五指山猪、梅山猪和金华猪等地方猪种精液的冷冻保存技术进行了研究，对冷冻稀释剂和保护剂进行了筛选[3-8]。我国地方猪种和培育品种繁多，对于这诸多品种猪精液的保存研究工作还有待进一步加强。

在人工授精过程中，精液的品质对于母猪的繁殖性能有着很大的影响。因此，在鲜精采集后需要对精液进行品质检测[9]，保证在其输入母猪子宫后能发挥其正常功能，减少母猪空怀，从而提高母猪的繁殖性能。同时，精液品质的好坏也能反映出种公猪的优良程度，并依据此调整公猪的饲粮、饲养管理方式，或直接淘汰。本试验采得关中黑猪鲜精的平均密度和pH均大于陈晓畅等的试验数据而采精量较小，其原因可能与猪只个体状况和季节有关。精液性状是关中黑猪种公猪繁殖性能的一项重要参考依据，在将来的工作中可以考虑通过大量的实践确定关中黑猪精液性状标准。

精液品质的鉴定主要包括采精量、颜色、pH、密度、活力、畸形率等指标，检测方法可以概括为感官检测和显微镜检测[10]。但是，不论是感官检测还是显微镜检测，对于指标的判定，主要是以人为主观来判定，极有可能会出现误差，因此在精液品质鉴定过程中，应该增加样本数以及取样数，求其平均值，真实、客观地反映出精液的品质。

目前，猪精液在常温条件下保存仍是最为常用的方法，而在这一过程中，稀释剂扮演着至关重要的角色。稀释剂一方面需要为精子提供其体外生存的营养物质、缓冲物质、抗冻物质等，以维持其形态、结构特征，另一方面还需要满足生产上的需要，使精液的使用率最大化。本试验选取的3种市售稀释剂，配方不同即其中所含的成分不同，对关中黑猪精液保存效果存在较大差异，其中日本某稀释剂保存效果最佳，在保存第5天精子活率仍高于70%，而在其他两种稀释剂中保存的精子活率均低于60%，这可能与日本某稀释剂中的抗氧化剂等特殊成分紧密相关。但不论何种品牌的稀释剂，在对精液保存时，都必须保证精子的各项生理指标都合格。一般而言，稀释剂的成分，成分浓度、配比都会影响到稀释剂对精液的保存效果。以葡萄糖为例，不仅能为精子的存活供给三磷酸腺苷（ATP）以及营养物质，还能起到维持其渗透压的作用，保持渗透压的稳定性[11]，此外，它还能起到保护精子质膜完整性的作用。但有研究表明，如果稀释剂中葡萄糖的浓度过高，则会对精子造成损伤[12]。pH和渗透压的稳定有利于稀释剂对精子的保存，所以，常常加入一些如碳酸氢钠（NaHCO3）、柠檬酸钠、Tris、HEPES等缓冲物质来调节稀释剂的pH[13]，而渗透压则可以通过添加葡萄糖之类的非离子物质维持其稳定。此外，在稀释剂中添加适量的氯化钾（KCl）能够延长精子的保存时间，其原理在于一定浓度的钾离子（K+）能维持精子膜上钠钾泵的运转，在膜外K+浓度较低的条件下，能够产生ATP维持精子的活动和生存。钙离子（Ca2+）能启动精子获能，这对精子的保存是极其不利的，因此，常常在稀释剂中加入能够螯合Ca2+的EDTA，从而减少进入细胞内的Ca2+，以达到预期保存效果。精液在保存的过程中，常常会受到细菌、真菌等污染物的污染，使精子出现畸变甚至死亡[14]。为此，稀释剂中会加入抗生素以避免污染物对于精子的侵害，但由于抗生素滥用现象普遍存在，使得很多细菌、真菌对于抗生素有着极大的耐药性[15]，因此开发新的抗菌药物势在必行。

4 结论

日本某稀释剂对关中黑猪精液常温保存效果要明显优于比利时某稀释剂和英国某稀释剂。此外，在对精子活率、顶体完整率和线粒体膜完整率保存效果上，比利时某稀释剂和英国某稀释剂较为接近；而在对质膜完整率的保存效果上，英国某稀释剂要优于比利时某稀释剂。

[1]王师泽.关中黑猪精液常温保存研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2014.

[2]陈晓畅，宋学太，王师哲，等.关中黑猪精液常温保存研究[J].畜牧兽医杂志，2015（2）：1-4.

[3]邢军，王建才，杨剑波，等.不同稀释剂对梅山猪精液冷冻保存效果的研究[J].畜牧与兽医，2013（12）：24-28.

[4]马红，王文涛，刘娣.民猪精液冷冻技术研究[J].猪业科学，2013（7）：124-125.

[5]马红，王文涛，刘娣.海藻糖对民猪精液冷冻保存的影响[J].畜牧与兽医，2014（11）：39-42.

[6]李玉芳，徐芹伟，张文昌，等.五指山猪精液冷冻保存研究[J].江西农业大学学报，2007（4）：612-615.

[7]王争光，华坚青，陈晓峰，等.不同抗氧化剂对金华猪精液冷冻保存效果的影响[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2010（1）：104-108.

[8]任俊玲，马恒东，李和平.不同抗氧化剂对猪精液冷冻保存效果的影响[J].中国畜牧杂志，2012（19）：37-41.

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[10]王一明，张海兰，谢鹏贵.猪精液品质检测与处理[J].当代畜禽养殖业，2010（6）：14-16.

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[15]Kuster C E,Althouse G C.The impact of bacteriospermia on boar sperm storage and reproductive performance[J].Theriogenology,2016,85(1)：21-26.

（编辑：富春妮）

The Effect of Guanzhong Black Pig's Semen Stored at Room Temperature in Three Commercial Extenders

LIU Zhaojun,XIE Jingxing,HOU Zhenkun,WEI Ning,YANG Gongshe,PANG Weijun
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China)

To evaluate the semen preservation effect of three kinds of commercial sperm extenders on Guanzhong black pig,we detected the sperm motility,membrane integrity,acrosome integrity and mitochondrial membrane integrity during sperm storage.Results showed that a certain kind of Japanese extender had the best preservation effect on Guanzhong black pig's sperm compared with the certain kind of Belgian extender and the certain kind of British extender(P＜0.05),the sperm motility of Japanese extender was 0.75,greater than 0.53 (Belgian extender group)and 0.51(British extender group)when save to 5 days.In addition,the preservation effect of Belgian extender and British extender on sperm motility,acrosome integrity and mitochondrial membrane integrity had no significant differences(P＞0.05).As for membrane integrity,the British extender group is better than the Belgian extender group(P＜0.05),Save to 5 days membrane integrity rates were 44.52%and 32.48%.

Guanzhong black pig;boar semen;commercial extenders;room temperature preservation

S828.3

A

1002-1957(2016)04-0033-04

2016-07-01

国家生猪产业技术体系（CARS-36）；西北农林科技大学试验示范站（基地）科技成果推广项目（TGZX2015-18）

刘兆军（1993-），男，江西吉安人，在读硕士研究生，研究方向为猪人工授精技术的研究工作.E-mail:liuzhaojun＠nwsuaf.edu.cn

庞卫军（1972-），教授，博士生导师，研究方向为肌肉生物学与猪遗传改良.E-mail：pwj1226＠nwafu.edu.cn