稀释方法、孵育温度和时间对冷冻-解冻后猪精液质量的影响

邓双义，张 伟*，王世银，唐志高

(1.新疆农业职业技术学院，新疆 昌吉 831100；2.新疆恒汇新牧种猪场，新疆 昌吉 831100)

猪精子对低温非常敏感，在冷冻过程中很容易由于冷打击而死亡[1]。虽然早在1956年Polge等[2-3]就首次成功冷冻猪精液并配种获得仔猪，但是到目前为止世界范围内猪冷冻精液应用比例不超过1%[4]。陈超等[5]研究表明，稀释密度为0.8×108～1.6×108/mL时，解冻后即时和2 h时的精子活力很高。以卵黄为基础的冷冻稀释液中加入乳糖和果糖的冻后活率要优于山梨糖醇[6]。Silva等[7]研究发现,以椰汁为基础的冷冻稀释液中加入5%的二甲基甲酰胺，可显著提高猪精子的冻后活率。郭堂玉等[8]研究表明，采用50 ℃解冻的猪冷冻精液，精子活率和质膜完整率显著高于37 ℃和70 ℃解冻温度组。近年来，猪精液冷冻技术取得了很大突破，精子冻后活率已达85%以上[9]。同时，母猪深部输精技术已在生产中大面积推广，在保证受胎率的同时大大降低了单次输入母猪子宫内有效精子数[10]。

虽然猪精液冷冻技术已开展了大量的研究并日趋成熟，精子冻后活率不断提高且渐趋稳定。但有关猪冷冻精液的解冻及解冻后处理方面的研究相对较少。本研究就猪冷冻精液解冻后的稀释方法、保存温度和时间对精液质量的影响进行了初步研究，以期为该技术的推广提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 冷冻精液 试验所用猪冷冻精液为购自国内某公司的长白猪细管冷冻精液，每个细管0.5 mL，约含2亿个有效精子。

1.1.2 仪器设备 全自动精子质量分析系统(scA780-54fc，法国卡苏)，生物显微镜(M200D，Motic)，恒温水浴锅，17 ℃恒温箱，50 L液氮罐。

1.2 试验方法

1.2.1 冷冻精液解冻 2个恒温水浴锅温度分别设置为50 ℃和36 ℃。从液氮罐中夹取所需数量的细管冻精，迅速投入50 ℃恒温水浴锅中保持16 s后迅速转入36 ℃恒温水域锅中。冻精在50 ℃恒温水浴锅中解冻期间，始终保持在水面以下，并不断晃动，以保证其均匀受热解冻。

1.2.2 不同稀释方法对精子活率和形态的影响 Ⅰ组冻精解冻后注入40 mL事先预热至36 ℃的稀释液中并轻轻震荡混匀备用。Ⅱ组冻精解冻后注入一个洁净的预热至36 ℃的空试管中，然后缓慢加入20 mL事先预热至36 ℃的稀释液，并轻轻震荡混匀，待精子适应5 min后再缓慢加入剩余20 mL等温的稀释液，使其达到40 mL的输精体积。

上述2种方法稀释的冷冻精液，在36 ℃恒温水域锅中孵育5 min后分别用洁净的玻璃棒蘸取1滴精液至于载玻片上，盖上盖玻片(避免气泡)，使用全自动精子质量分析系统测定活率。同时采用马红等[11]描述的方法评定质膜完整率和顶体完整率，以评估2种稀释方法对精子形态结构的影响。

1.2.3 不同保存温度和时间对解冻后冷冻精液活率的影响 采用两步稀释法稀释4支细管冻精，在36 ℃恒温水域锅中孵育5 min后测定精子活率，然后将其分为2份，每份20 mL。其中1份仍然置于36 ℃恒温水浴锅中，每隔5 min测定1次精子活率，直至精子活率低于40%为止；另1份包裹毛巾后至于17 ℃恒温箱中，第一天每隔5 h测定1次精子活率，从第2天开始每隔12 h测定1次精子活率，直至精子活率低于50%为止。

1.2.4 数据分析 上述试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示，实验数据用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同稀释方法对精液冻后活率及形态的影响

由表1可知，Ⅱ组精子冻后活率为82.6%，极显著高于Ⅰ组精子活率(P<0.01)。Ⅱ组精子解冻后质膜完整率和顶体完整率均极显著高于Ⅰ组(P<0.01)，说明两步稀释较一步稀释可有效缓解稀释打击。另外，Ⅰ组中是将解冻后的细管精液注入到稀释液中，加重了稀释打击效应，这也可能是其精子活力、质膜完整率和顶体完整率较低的原因。

表1 不同稀释方法对猪冷冻精液冻后活率和形态的影响Table 1 The effect of dilution methods on motility rate after freezing and shape of thawed swine semen %

2.2 不同保存时间和温度对解冻后精液活率的影响

从表2数据可见，猪冷冻精液解冻、稀释后保存于36 ℃的恒温水浴锅中，5 min、10 min和15 min三次测定结果差异不显著(P>0.05)。随着保存时间的延长，精子活率会出现较快的下降，20 min和25 min的测定结果显著低于前15 min 的精子活率(P<0.05)，且显著高于第30 min的精子活率(P<0.05)，30 min后精子活率以更快的速度下降，35 min和40 min时精子活率极显著低于30 min前的精子活率(P<0.01)。但是在40 min的保存时间内，未见精子质膜完整率和顶体完整率出现显著变化(P>0.05)。

表2 不同保存温度和时间对解冻后冷冻精液活率的影响Table 2 The effect of storage temperature and time on motility rate and shape of thawed swine semen

猪冷冻精液解冻、稀释后保存于17 ℃的恒温箱中，精子活率可得到较长时间的保持(表2)。15 h内精子活率、质膜完整率和顶体完整率均无显著差异(P>0.05)，第20 h时精子活率和质膜完整率显著低于前期检测结果(P<0.05)，但顶体完整率和前期检测结果差异不显著(P>0.05)。保存至20 h以后精子各项指标均出现较快的下降，至48 h时精子活率、质膜完整率和顶体完整率已极显著低于前20 h的测定结果(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 稀释对解冻后精子活率及形态的影响

猪为多胎动物，子宫角长，需要输入足量体积和有效精子数的精液，才能保障正常的情期受胎率和产仔数。生产中，新鲜精液常规输精的体积一般每次为80 mL(约含80亿有效精子)，即使采用深部数据技术，输精量一般也在60 mL(约含60×108有效精子)[10]。所以，猪细管冷冻精液解冻后需要用稀释液稀释至一定体积后才能输精。

目前，猪冻精生产企业提供了专用的瓶装稀释液，用于解冻后细管冻精的稀释，体积一般是每瓶40 mL。实际生产中为了操作方便，将解冻后的细管冻精直接注入稀释液中进行稀释。按照精液稀释的操作要求，应将稀释液缓慢加入精液并轻轻混匀，若进行高倍稀释时应进行两步稀释[13]，以最大限度的避免稀释打击[12]。可见上述操作显然是不符合精液稀释操作要求。从试验结果亦可以看出，同一批细管冻精，在同样的解冻温度和时间下，采用两步稀释并采用正确的稀释方法将稀释液加入精液中(Ⅱ组)，所得精子冻后活率、质膜完整率和顶体完整率均极显著高于企业推荐的稀释方法(Ⅰ组)(P<0.01)，从精子质膜完整率和顶体完整率出现极显著下降可以推断，精子冻后活率的下降是由于精子结构损伤所致。

精子作为一种特殊的细胞，其结构很容易受到外界因素的影响。马红等[13]的研究表明，离心力和离心时间的增加不利于精子质量的保持，当使用1 000×g和1 200×g离心力猪精液时，猪精子质量会出现显著下降，采用800×g的离心力离心15 min可获得最佳的离心效率和冻后精子质量。刘莉等[14]发现，冷冻前17 ℃过夜保存对猪精子结构未见明显影响，但是从17 ℃降温至4 ℃，以及4 ℃平衡1.5 h均对精子结构产生一定程度的损伤。猪冷冻精液制作及使用是一个系统的操作过程，主要包括稀释、离心、二次稀释、降温平衡、灌装、冷冻、解冻和三次稀释等技术环节，每一步均会对精子有不同程度的损伤。本试验对解冻后猪精子稀释方法的研究，可为优化猪冷冻精液解冻后稀释操作进而提高猪精子冻后活率提供数据支持。

3.2 解冻后保存温度和保存时间对猪冷冻精液解冻后精子活率及形态的影响

解冻、稀释后的冷冻精液一般都置于36 ℃的恒温水浴锅中暂时保存，待解冻完所需冻精后再送到猪舍输精。但是解冻、稀释后的猪冷冻精液36 ℃保存多长时间不会影响精子冻后活率和质量尚未见文献报道。母猪散养户大多既没有实验室条件，也没有专业技术人员，使用的冻精一般根据其需求量解冻、稀释好以后再配送，所以从解冻到输精中间要间隔较长的时间，需要将精液暂时保存于17 ℃的恒温箱中进行配送，但是解冻后的猪冻精在17 ℃可以保持多少时间较为可靠亦鲜有文献报道。

上述两种情况给实际生产中猪冷冻精液的使用造成了很多困扰，也可能是目前猪冷冻精液配种成绩差异较大的重要原因[15-17]。本研究结果表明，猪冷冻精液解冻、稀释后保存于36℃的恒温水浴锅中，15 min内精子活率无显著降低(P>0.05)，20 min后精子活率即开始迅速降低(P<0.05)，由于精子质膜完整率和顶体完整率未出现显著变化(P>0.05)，可能原因是精子快速运动导致能量耗尽而死亡所致，所以最好在解冻后15 min内完成输精。考虑到实际生产中解冻、稀释的精液带出实验室后温度一般均会低于36 ℃，精子运动速度降低，自身携带的能量可以维持更长的时间，精子活率下降速度亦随之变慢，所以最多应该在解冻后30 min内完成输精。解冻、稀释后保存于17 ℃恒温箱中15 h内的猪精液精子活率、质膜完整率和顶体完整率均无显著差异(P>0.05)，此后各项指标即以较快的速度下降。所以，给母猪散养户配送的精液，必须解冻、稀释后保存于17 ℃恒温箱中，最好在15 h内完成配送和输精。

4 结 论

本研究对猪冷冻精液解冻后的稀释方法、保存温度和时间对精子质量的影响进行了研究，发现与冻精一步稀释法相比，采用两步法稀释可极显著提高精子的冻后活率、质膜完整率和顶体完整率。