固相萃取/气相色谱法测定新会陈皮及其制品中8种有机磷农药

彭晓俊,梁伟华,彭 梅，梁优珍

(新会出入境检验检疫局,广东 江门 529100)



固相萃取/气相色谱法测定新会陈皮及其制品中8种有机磷农药

彭晓俊*,梁伟华,彭 梅，梁优珍

(新会出入境检验检疫局,广东 江门 529100)

建立了固相萃取/气相色谱同时测定新会陈皮及其制品中8种有机磷农药的分析方法，并对影响提取、净化、检测效率的因素进行优化。样品用乙酸乙酯提取，自制改性多壁碳纳米管和N-丙基乙二胺2 种填料分层填装的双层固相萃取小柱净化，Shimadzu Rtx-1701毛细管色谱柱分离，火焰光度检测器检测，外标法定量。在优化实验条件下，8 种有机磷农药在0.020～1.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.997 0～0.999 2，检出限(S/N=3)为3.6～8.8 μg/kg。3 个加标水平下的平均回收率为72.5%～106%，相对标准偏差为2.8%～8.7%。该法准确、快速、灵敏﹑操作简单，可满足新会陈皮及其制品中多种有机磷农药残留同时测定的要求。且自制柱的成本低，能够大幅度减低使用成本，值得推广应用。

有机磷农药;农药残留;自制双层固相萃取柱;气相色谱(GC);新会陈皮

新会陈皮是不可多得的药食同源、食养俱佳的地方特产，为广东十大地道中药材之一，是“广东三宝”(陈皮、老姜、禾秆草)的第一宝。有机磷农药(OPPs)因杀虫谱较广、杀虫速度快、价格低，是使用量最大的杀虫剂[1]，但其急性毒性相对较大[2-3]。近年来，有文献指出新会陈皮中存在有机磷农药污染现象，这对新会陈皮及其制品食品安全有极大威胁，也影响了新会陈皮及其制品的出口竞争力和产品声誉[4]。因此，很有必要建立新会陈皮及其制品中有机磷残留的测定方法。

农产品中有机磷残留的检测方法主要有气相色谱法(GC)[5-6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7-9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-11]、免疫分析法(ELISA)[12-13]等，其中GC/FPD检测法对有机磷农药的检测具有选择性好、灵敏度高等特点，因此成为有机磷农药的常用分析方法。在我国现行有机磷农药检测国标和行标中[14-17]，其样品前处理大量使用重蒸二氯甲烷或丙酮。但二氯甲烷是致癌物，损害人的中枢神经和呼吸系统，而丙酮对人的肝肾和胰腺损害极大，二者的重蒸和使用对检测人员健康有一定的风险。此外，以上标准前处理需使用商品固相萃取(SPE)柱，价格高且多为单层填料。新会陈皮特有的某些挥发油、黄酮化合物、生物碱等化学成分用现行检测方法不易除去，加之还有蛋白质、脂肪、糖和有机酸等组分，采用单层填料固相萃取柱净化时，依然存在较多杂质干扰。本研究选用改性多壁碳纳米管(MWNTs)和N-丙基乙二胺(PSA) 2 种填料分层填装的自制固相萃取小柱，利用不同填料不同官能团的特性，达到去除样品中不同性质干扰物的目的。以自制混合柱代替商品固相萃取柱，建立了成本低廉、绿色环保、准确快速的分析方法，能大幅度地降低使用成本，为新会陈皮及其制品的食品安全监督提供了可靠的检测手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-QP 2010 Ultar 气相色谱-质谱联用仪，包括FPD检测器、AOC-20si自动进样系统(日本岛津公司)；SGH-300高纯氢发生器(北京东方精华苑公司)；KQ 2200DB 型超声振荡器(昆山超声仪器有限公司)；2-16 型通用台式高速离心机(德国Sigma公司)；IKA 涡旋混合器；DN-12 W 氮吹仪(上海比郎公司)；固相萃取装置(美国Supelco公司)；固相萃取空柱管(10 mL，上海德理安公司)。

灭线磷、治螟磷、特丁硫磷、久效磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、甲基异柳磷、水胺硫磷8 种有机磷农药标准品(1 mL，100 μg/mL，农业部环境保护科研检测所)；丙酮、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯，德国默克公司)；C18填料(平均粒度45 μm，比表面积480 m2/g，苏州赛分公司)；PSA填料(平均粒度45 μm，孔体积0.8 m3/g，山东奥秘公司)；MWNTs填料(纯度>95%，直径10～20 nm，长度300～800 nm，深圳市纳米港有限公司)；实验用水为去离子蒸馏水。

1.2 GC条件

色谱柱：Shimadzu Rtx-1701(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：高纯氦气(纯度>99.999%)；流速：1.0 mL/min；进样量：1.0 μL；进样方式：程序升温不分流进样；升温程序：初始100 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升温至220 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升温至250 ℃，保持10 min；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；检测器：火焰光度检测器(FPD)；磷滤光片：526 nm；燃烧气：氢气(纯度>99.999%)，流速：62.5 mL/min；助燃气：空气，流速：90.0 mL/min。

1.3 自制固相萃取小柱

1.3.1 改性MWNTs填料的制备 称取20 g MWNTs置于500 mL单口烧瓶中，加入90 mL浓硫酸，超声2 h；再向烧瓶中加入30 mL浓硝酸，超声1 h，移入恒温油浴槽中，于120 ℃下回流1 h，冷却，静置，用吸管吸除上层混酸清液，然后加入1 000 mL水稀释，稀释液过微孔滤膜，反复用水冲洗滤渣直至滤液的pH值为7.0，所得黑色固体经真空烘箱50 ℃下干燥，即得改性MWNTs。

1.3.2 装柱及活化 取10 mL固相萃取空柱管，底部铺上筛板，装入0.5 g MWNTs，轻轻敲打使之均匀填充，再加入0.5 g PSA，轻轻敲打，压好筛板，即得自制固相萃取小柱。使用前依次用6 mL甲醇、6 mL乙酸乙酯活化。

1.4 样品处理

新会柑、陈皮酱、陈皮花色饼、陈皮梅样品：称取2.00 g样品于50 mL离心管中，加入2 mL水，振荡1 min，超声10 min，加入5 mL乙酸乙酯，超声10 min，3 000 r/min离心5 min，吸取上层清液，再加入3 mL 乙酸乙酯重复提取1次，合并上清液，混匀。

新会陈皮、柑普茶样品：称取2.00 g样品置于50 mL离心管中，加入4 mL水，振荡1 min，超声10 min，加入5 mL乙酸乙酯，超声10 min，3 000 r/min 离心5 min，吸取上层清液，再加入5 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并上清液，混匀。

将混匀后的上清液过自制固相萃取小柱，整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min，收集流出液，吹干，残留物用1 mL乙酸乙酯定容，振荡1 min，溶液过0.22 μm有机相滤膜上机测定。

2 结果与讨论

2.1 MWNTs表面改性

MWNTs奇特的准一维中空管结构以及高的比表面积，使之作为萃取填料具有优异的性能。但未改性的MWNTs由于大的比表面积、相互之间范德华力作用以及表面缺少亲水的官能基团，使其在有机溶剂和水中的分散性差，从而限制了其在吸附领域的应用，因此须对MWNTs进行表面改性，使其表面产生一定量的羟基、羧基等活性官能基团。

图1 MWNTs改性示意图Fig.1 Scheme of modification of MWNTs

Liu等[18]用混酸对MWNTs进行化学处理，结果在MWNTs表面得到一些带氧官能基团。本方法在此基础上进行了调整，先超声将MWNTs与浓硫酸均匀混合，以除去其表面加工过程中吸附的催化剂金属颗粒，再加入浓硝酸均匀混合，置入120 ℃的恒温油浴槽回流，以确保MWNTs与混酸充分接触，提高氧化效率，最后在反应物中加水停止反应，氧化改性流程见图1，MWNTs改性前后的TEM照片见图2。由图2可见，改性后MWNTs均匀分散，有一定的长径比且长度分布均匀，可见本法氧化改性处理效果好。将改性前后MWNTs进行傅立叶变换红外光谱(FT-IR)检测，发现改性后的MWNTs在3 734 cm-1处有羧基(—COOH)的特征峰，在3 414 cm-1处出现羟基(—OH)的伸缩振动峰，证实MWNTs表面产生了—COOH和—OH的官能基团。

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1 与其他SPE吸附填料的比较 为考察MWNTs作为吸附填料对有机磷的富集能力，本文对MWNTs和常规使用的弗罗里硅土、活性炭的吸附性能进行了比较，在陈皮、柑普茶中添加100 μg/kg的混合标准品，分别过MWNTs柱、弗罗里硅土柱以及活性炭柱。结果表明，弗罗里硅土柱的洗脱液呈浅黄色、浅绿色或绿色，对目标化合物色谱峰有干扰。MWCNTs柱和活性炭柱的洗脱液几乎无色，对目标化合物色谱峰无干扰，其中MWNTs柱的有机磷回收率为88%～105%，活性炭柱的有机磷回收率为66%～84%，这也表明MWNTs作为固相萃取吸附填料有着很好的应用前景。

2.2.2 填料净化效果的考察 新会陈皮所含化学成分多且种类复杂，需使用固相萃取技术净化。根据有机磷的特性，首先选用单一填料PSA,C18,MWNTs,Al2O3柱进行净化。C18填料对蛋白质、脂肪、维生素等杂质有较高的吸附量，但也能牢固吸附目标化合物；PSA 填料能有效吸附黄酮、生物碱、糖类、酚类、脂肪酸、有机酸和色素等杂质；MWNTs可有效除去样品中的水溶性和脂溶性杂质；中性Al2O3填料适用于分离醛、酮、醌和硝基化合物，也可分离弱的有机酸和碱等。采用0.20 μg/mL 有机磷农药标准溶液过上述4种固相萃取柱，并测定其回收率。结果显示，PSA,C18,MWNTs,Al2O34 种固相萃取柱的回收率分别为86%～105%，88%～110%，93%～102%和0～78%。其中过Al2O3柱时，特丁硫磷及甲基异柳磷均未检出，表明Al2O3填料对这些农药吸附严重，而采用其他3 种固相萃取柱时，8种有机磷农药均能被有效洗脱，所以本方法不考虑使用Al2O3填料进行净化。

2.2.3 双层填料的选择 新会陈皮所特有的某些挥发油、黄酮化合物、生物碱、色素以及自身的气味会严重干扰目标分析物的测定，同时也缩短了色谱柱的使用寿命。研究显示，选用单一填料的固相萃取小柱时，去除杂质的效果不明显。为得到较好的净化效果，将3 种固相萃取填料(PSA，C18，MWNTs)两两组合，自制固相萃取小柱。结果显示，使用PSA+C18和C18+MWNTs这两种组合填料的固相萃取柱时，杂质峰数量多，会干扰结果分析，导致某些目标化合物的回收率低。而通过PSA+MWNTs填料柱净化后，杂质峰对目标峰无干扰，各目标化合物可获得较高回收率，且使用自制混合型固相萃取柱(PSA+MWNTs)进行前处理时，这2种填料能在广泛的pH值范围内保持稳定，保证了净化效果及方法的通用性。因此，实验选用PSA+MWNTs作为自制固相萃取柱的吸附填料。

2.2.4 填料用量的选择 考察了填料(PSA∶MWNTs=1∶1)用量分别为0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 g时对4 种有机磷农药的萃取效率。相对于其他化合物，有机磷农药含π电子少，随着填料用量增加，杂质与填料能形成更强的π-π吸附而减少了对有机磷的干扰，使得有机磷的回收率增大，当填料用量为1.0 g时回收率最高，继续增加填料用量，有机磷农药因萃取损失导致回收率下降。因此，选择填料的最佳用量为1.0 g。

2.2.5 洗脱方式的选择 将0.20 μg/mL有机磷农药标准溶液过柱，收集流出液后，分别选用6 mL乙酸乙酯、乙腈、丙酮3种洗脱方式(以乙酸乙酯洗脱为例，收集流出液，再加入6 mL乙酸乙酯过柱，收集乙酸乙酯液)和直接吹干进行比较。结果表明，收集完流出液，固相萃取柱直接吹干后，有机磷农药的回收率不低于其他3种洗脱方式，故采用流出液收集后直接吹干，不需另外选用洗脱剂。

2.3 提取溶剂的选择

样品在有机溶剂提取前加水浸润，便于有机溶剂的渗入和提取。有机磷农药属极性化合物，依据提取溶剂与目标分析物之间“相似相溶”的原则，其常用提取剂有丙酮、乙腈和乙酸乙酯等，本实验分别对上述溶剂的提取效率进行了考察。选取极性不同的灭线磷、特丁硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷农药作为考察物，并以回收率作为考察指标，在新会陈皮空白样品中添加25 μg/kg混标，考察不同提取溶剂的提取效率。结果显示，丙酮的极性强，能有效提取极性的有机磷农药，但同时也将大量杂质提取出且丙酮提取物的水含量高，不利于后续浓缩。乙腈作为提取溶剂时，脂溶性的杂质不被提取，但其毒性较强且沸点高以致浓缩困难。而以乙酸乙酯为溶剂进行超声提取时，有机磷农药在溶剂中能稳定存在，不会降解且提取液可直接上柱净化，提高了提取效率，还能最大程度地降低杂质干扰，获得较高回收率，故选取乙酸乙酯作为提取溶剂。

2.4 超声时间的优化

超声可加速目标化合物在样品和提取溶剂之间平衡的过程，因此超声时间是重要的影响因素。实验考察了超声时间分别为2，5，10，15 min时对提取效率的影响。结果显示，随着超声时间的延长，有机磷农药的回收率增大，超声10 min时，有机磷农药的回收率达到最高，继续延长超声时间，由于超声提取过程中产生热量而造成有机磷农药分解，导致回收率降低，因此选择超声时间为10 min。

2.5 线性范围、精密度及检出限

先用乙酸乙酯将8 种有机磷农药标准溶液稀释成4.00 μg/mL的标准储备液，再用乙酸乙酯将8 种有机磷农药储备液配制成浓度为0.020，0.050，0.20，0.50，1.0 μg/mL的系列混合标准工作溶液。在优化色谱条件下，以峰面积(y)为纵坐标，对应质量浓度(x,μg/mL)为横坐标进行线性回归。8 种有机磷农药在0.020～1.0 μg/mL范围内呈良好的线性关系(见表1)。测定质量浓度为0.20 μg/mL混合标准溶液6 次，计算精密度。以信噪比S/N=3计算检出限(LOD)为3.6～8.8 μg·kg-1，满足微量甚至痕量测定的要求。

表1 8种有机磷农药的保留时间、线性方程、相关系数、检出限及相对标准偏差

y:peak area;x:mass concentration,μg/mL

2.6 实际样品分析

在上述最优条件下将所建立的方法应用于新会柑、新会陈皮、柑普茶、陈皮酱、陈皮花色饼和陈皮梅等样品中有机磷农药的测定，在实际样品中分别添加10，50，100 μg/kg 3个水平的目标物，代表性样品的回收率结果见表2，色谱图见图3。由图3可见，目标化合物峰完全分离，不受相邻杂质峰干扰。8种有机磷农药的回收率为72.5%～106%，相对标准偏差(RSD)为2.8%～8.7%，满足痕量分析的要求。

表2 8种有机磷农药的加标回收率及相对标准偏差(n=6)

*no detected

3 结 论

本文通过将改性MWNTs和PSA 2种填料分别填装至固相萃取柱，将自制双层固相萃取柱与GC技术结合用于新会陈皮及其制品中8 种有机磷农药残留的测定。方法的准确度高、灵敏度好﹑操作简单快速，满足农产品中农残痕量分析的要求。此外，使用本文研制的双层固相萃取柱，能大幅减低使用成本，因此本柱值得推广应用于其它痕量有机污染物的前处理。

[1] Wu Y,Kang Q H,Gao K Y,Li Z B.Chin.J.Anal.Chem.(吴岩,康庆贺,高凯扬,李志斌.分析化学),2009,37(5): 753-757.

[2] Zhang C X,Hou M,Bao H Y,Liu M,Wu H T,Song Y,Wang H J.J.QinghaiNormalUniv. :Nat.Sci.(张呈祥,侯明,鲍海咏,刘梅,吴海涛,宋玉,汪浩杰.青海师范大学学报: 自然科学版),2012,(1): 54-61.

[3] Chen Z J,Wang Y,Li M Y,Sun Y M,Xu Z L.J.Instrum.Anal.(陈子键，王宇，李美英，孙远明，徐振林.分析测试学报),2015,34(11): 1315-1323.

[4] Wang J,Cao S R,Zhang L,Xu F,Wang G M,Li X L.J.Instrum.Anal.(王均,曹淑瑞,张雷,徐芬,王国民,李贤良.分析测试学报),2013,32(11):1309-1315.

[5] Zhao W J,Sun X K,Deng X N,Huang L,Yang M M,Zhou Z M.FoodChem.,2011,127(2): 683-688.

[6] Li Y M,Yang M,Tan W,Yang H X,Gao S Q,Li G Z,Wang H B.Sci.Technol.FoodInd.(李杨梅,杨敏,谭伟,杨宏兴,高斯祺,李桂镇,王红斌.食品工业科技),2014,35(19): 316-320.

[7] Gao R,Rao Z,Guo X C,Huang Y,Li X J.J.Instrum.Anal.(高冉,饶竹,郭晓辰,黄毅,李晓洁.分析测试学报),2014,33(5): 539-544.

[8] Wu L J,Song Y,Hu M Z,Xu X,Zhang H Q,Yu A M,Ma Q,Wang Z M.Talanta,2015,134: 366-372.

[9] Wang Z M,Zhao X,Xu X,Wu L J,Su R,Zhao Y J,Jiang C F,Zhang H Q,Ma Q,Lu C M,Dong D M.Anal.Chim.Acta,2013,760: 60-68.

[10] Yang D S,Mei W Q,Wang L X,Geng H C,Shao J L,Chen X L.SouthwestChin.J.Agric.Sci.(杨东顺,梅文泉,汪禄祥,耿慧春,邵金良,陈兴连.西南农业学报),2015,28(5): 2136-2141.

[11] Sanagi M M,Salleh S,Ibrahim W A W,Naim A A,Hermawan D,Miskam M,Hussain I,Aboul H Y.J.FoodCompos.Anal.,2013,32(2): 155-161.

[12] Xu Z L,Sun W J,Yang J Y,Jiang Y M,Campbell K,Shen Y D,Lei H T,Zeng D P,Wang H,Sun Y M.J.Agric.FoodChem.,2012,60(9): 2069-2075.

[13] Prince A E,Fan T S,Skoczenski B A,Bushway R J.Anal.Chim.Acta,2001,444(1):37-49.

[14] GB/T 5009.20-2003.Determination of Organophosphorus Pesticide Residues in Foods.National Standards of the People's Republic of China (食品中有机磷农药残留的测定.中华人民共和国国家标准).

[15] GB/T 5009.145-2003.Determination of Organophosphorus and Carbamate Pesticide Multiresidues in Vegetable Foods.National Standards of the People's Republic of China(植物性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定.中华人民共和国国家标准).

[16] GB/T 14553-2003.Method of Gas Chromatographic for Determination of Organophosphorus Pesticides in Cereals,Fruits and Vegetables.National Standards of the People's Republic of China(粮食、水果和蔬菜中有机磷农药测定的气相色谱法.中华人民共和国国家标准).

[17] NY/T 761-2008.Pesticide Multiresidue Screen Methods for Determination of Organophosphorus Pesticides,Organochlorine Pesticides,Pyrethroid Pesticides and Carbamate Pesticedes in Vegetables and Fruits.National Standards of the People's Republic of China(蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定.中华人民共和国农业部标准).

[18] Liu J,Rinzler A G,Dai H,Hafner J H,Bradley R K,Boul P J,Lu A,Iverson T,Shelimov K,Huffman C B,Rodriguez M F,Shou Y,Lee T R,Colbert D.Science,1998,280:1253-1256.

Determination of 8 Organophosphorus Pesticides in Xinhui Dried Orange Peel and Its Products by Gas Chromatography with Solid Phase Extraction

PENG Xiao-jun*, LIANG Wei-hua, PENG Mei, LIANG You-zhen

(Xinhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jiangmen 529100,China)

A method of gas chromatography(GC) coupled with solid phase extraction was established for the simultaneous determination of 8 kinds of organophosphorus pesticide residues，including ethopropophos,sulfotep,terbufos,monocrotophos,parathion methyl,fenitrothion,isofenphos methyl and isocarbophos in xinhui dried orange peel and its products.The factors affecting extraction，purification and detection efficiency were optimized，and the optimal conditions were as follows：the samples were extracted with ethyl acetate，and purified on a homemade double solid phase extraction column packed with N-propylethylenediamine and multi-walled carbon nanotubes.The separation of target compounds were performed on a film thickness of Shimadzu Rtx-1701 capillary column(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，and the quantitative analysis of organophosphorus pesticides was carried out by GC with flame photometric detector and the external standard method.Under the optimized conditions，the calibration curves of 8 organophosphorus pesticides were linear in the range of 0.020-1.0 μg/mL with correlation coefficients of 0.997 0-0.999 2．The detection limits(S/N=3)were in the range of 3.6-8.8 μg/kg．The recoveries of the pesticides in Xinhui dried orange peel and its products at three spiked levels ranged from 72.5%to 106%，with relative standard deviations of 2.8%-8.7%. With the advantages of accuracy,sensitivity，easy operation and rapidness,the method is applicable in the simultaneous determination of 8 kinds of organophosphorus pesticides in Xinhui dried orange peel and its products.The homemade column is worthy of popularization and application as it is inexpensive,and could largely reduce the detection cost.

organophosphorus pesticides;pesticide residues;homemade double solid phase extraction column;gas chromatography(GC);xinhui dried orange peel

2016-04-10；

2016-05-05

2015年江门市农业攻关计划

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.008

O657.71;F767.2

A

1004-4957(2016)10-1267-06

*通讯作者：彭晓俊,硕士,高级工程师,研究方向:食品安全检测,Tel:0750-6312077,E-mail:pxj2129@163.com