TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中聚醚类抗生素的研究

曹亚青,宋 歌,王曼曼，王学生*，艾连峰*

(1.华北理工大学 公共卫生学院，河北 唐山 063000；2.河北出入境检验检疫局，河北 石家庄 050000)



TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中聚醚类抗生素的研究

曹亚青1,宋 歌2,王曼曼1，王学生1*，艾连峰2*

(1.华北理工大学 公共卫生学院，河北 唐山 063000；2.河北出入境检验检疫局，河北 石家庄 050000)

建立了TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法快速同时测定牛奶、鸡肉和鸡蛋中拉沙洛菌素、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素、马杜霉素和尼日利亚菌素残留的方法。样品提取液经在线净化柱Cyclone-p净化，Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm × 2.1 mm，5 μm)色谱柱分离，电喷雾正离子模式测定，整个分析过程仅13 min。方法在1～100 μg/L范围内呈良好线性关系(r≥0.999)，定量下限为1 μg/kg，在动物源性食品中3个加标水平下的回收率为71.9%～109.0%，相对标准偏差为1.5%～14.9%。

TurboFlow在线净化；液相色谱-串联质谱；聚醚类抗生素；动物源性食品

聚醚类抗生素(Polyether antibiotics)又名离子载体抗生素，作为高效、广谱的抗球虫药和促生长剂已广泛应用于畜禽饲养业。然而聚醚类抗生素的不合理使用会导致动物产品中的兽药残留，从而危害食用者的健康。加拿大、美国、日本和中国对食品中聚醚类抗生素的最大残留限量进行了严格规定，低至0.008 mg/kg；欧盟规定在饲料中禁止使用莫能菌素、盐霉素[1-3]。我国是农业大国，日常兽药残留检测工作繁重。因此，建立准确、快速的动物源性食品中聚醚类抗生素的残留分析方法十分必要。

目前，聚醚类抗生素残留检测主要采用液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC-MS)[4-8]。但由于食品组成复杂，且被分析物处于痕量状态，需富集才能检出，因此，样品前处理成为食品分析过程中的必要环节。通常，样品预处理占用整个分析方法所用时间的2/3；对于聚醚类抗生素前处理目前多采用离线的固相萃取法，步骤较多、耗时，易出现人为操作误差和污染。TurboFlow在线净化技术结合了扩散、化学和体积排阻的原理，净化柱为第一维色谱柱系统，样品通过净化柱净化、富集后进入切换阀的接口，经捕集后，切换进入分析柱(第二维色谱柱)和检测器，即在捕获目标分析物的同时快速净化样品。同时，商品化的净化柱可重复使用，简化了前处理操作，降低了测定成本。由于方法简单快速，自动化程度高，该技术已成功用于食品中化学污染物的分析测定[9-16]。

本文采用TurboFlow在线净化技术进行样品预处理，液相色谱-串联质谱技术进行分离检测，从而实现了动物源性食品中聚醚类抗生素残留的分析，方法简便、灵敏度高，可用于动物源性食品中聚醚类抗生素的快速定性定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TurboFlow在线净化液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS，美国Thermo Fisher公司)：包括CTC多功能自动进样器、两个四元梯度液相泵、六通阀切换装置、多元柱切换装置和TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪。AH-20全自动均质器(中国睿科仪器有限公司)；3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司)。

乙腈、丙酮、甲醇(色谱纯，美国Fisher 公司)。聚醚类抗生素标准品：拉沙洛菌素(纯度98.0%)、盐霉素(75.5%)、莫能菌素(98.0%)、马杜霉素(85.5%)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲基盐霉素(98.0%)购自加拿大TRC公司；尼日利亚菌素(98.0%)购自英国Apollo Scientific Limited公司；用甲醇配制浓度为1 mg/mL的标准储备液，冷藏、避光保存。

1.2 样品前处理

称取牛奶、均质的鸡肉和鸡蛋样品5 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈和5 g无水硫酸钠。鸡肉和鸡蛋样品均质提取1 min，牛奶涡旋振荡提取1 min；样品以10 000 r/min离心10 min后用10 mL乙腈再次提取，合并上清液，分取5 mL上清液氮吹至干，准确加入1 mL甲醇-水(体积比8∶2)溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

图1 在线净化模式及流路模式切换图Fig.1 The modes of on-line SPE systemA：loading and washing；B：eluting

1.3 在线净化色谱条件

在线净化程序包括净化(上样泵)和分离(分析泵)，净化步骤主要靠其配置的四元耐压泵驱动，样品在净化柱上净化和富集；经过以上步骤后，通过阀切换技术，将净化后的物质在分析柱上进行分离和分析，程序中各步所用流路模式见图1。以Cyclone-p柱(50 mm× 0.5 mm，60 μm)为固相萃取柱，流动相A为0.5%甲酸水溶液，B为乙腈，C为丙酮-乙腈-异丙醇(体积比1∶1∶1)，进样体积为50 μL。分析柱为Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm×2.1 mm，5 μm)，流动相A为0.5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。在线净化程序见表1，其中净化过程(OCC)在程序中每步的变化采用瞬变模式，而HPLC采用渐变模式。整个分析时间需13 min，在2.5 min开始至第3 min切入质谱系统。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，温度：300 ℃；毛细管电压：3 200 V；多反应监测(MRM)正离子扫描模式；鞘气压力：30 units；辅助气压力：5 units；离子源温度：320℃；源内诱导解离电压：10 V；Q1,Q3单位分辨率：0.7 U；其他测定条件见表2。

表1 在线净化和液相色谱-质谱分析动物源性食品中聚醚类抗生素的实验条件

表2 分析物的保留时间和MRM分析质谱参数

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

聚醚类抗生素易溶于中等极性有机溶剂，因此实验分别采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和异辛烷作为提取溶剂进行提取。结果发现，甲醇、乙酸乙酯和异辛烷提取的杂质较多，回收率均达不到80%，而选用乙腈提取时回收率均大于70%，因此选择乙腈作为提取溶剂。

2.2 TurboFlow净化条件的建立

TurboFlow在线净化过程主要包括上样、洗脱、转移和淋洗步骤。实验采用不接分析柱，分流进入质谱方式优化各步条件。考虑到聚醚类化合物属中等弱极性化合物，所以选择具有类似反相柱性质的Cyclone-p为净化柱，分别考察了甲酸(0.5%和0.1%)水溶液、10 mmol/L乙酸铵溶液以及10 mmol/L乙酸铵-0.1%乙酸水溶液作为上样流动相时对6种聚醚类抗生素的影响。结果显示，6种聚醚类抗生素在以上流动相条件下均能有效保留，当以0.5%甲酸水溶液为上样液时，6种聚醚类抗生素的峰形最佳、响应值最高，即上样损失率最低，所以选择0.5%甲酸水溶液作为上样流动相。

实验考察了不同比例的乙腈和0.5%甲酸水溶液流动相对目标化合物的洗脱效果。结果显示极性最大的拉沙洛菌素需使用100%乙腈才能洗脱完全，故采用乙腈作为洗脱溶剂。

2.3 分离条件的建立

净化柱洗脱下的目标物通过分析柱进行分离，净化过程的洗脱液和分离时HPLC流动相的初始比例会影响目标化合物的峰形及分离度。实验分别选择0.5%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、10 mmol/L乙酸铵溶液以及10 mmol/L乙酸铵-0.1%乙酸水溶液作为水相，有机相分别为甲醇和乙腈，进行流动相的选择实验。结果发现，以0.5%甲酸水溶液为水相，乙腈为有机相，采用时间梯度洗脱条件时(表1)，6种化合物的峰形最佳。

2.4 线性范围与基质效应

选用牛奶、鸡蛋和鸡肉空白基质溶液配制浓度在1～100 ng/mL范围的基质加标溶液及相同浓度的标准溶液。以分析物的峰面积(y)对标准溶液中被测组分的浓度(x，μg/L)作图。以基质匹配标准曲线和标准溶液曲线斜率的比值(Ratio of slope)来考察基质效应的强弱，当两者斜率的比值高于1.2或低于0.8时说明基质效应较强，影响结果的定量。以鸡蛋样品为例(如表3)，未使用在线净化柱时，基质对分析物的响应具有抑制作用，响应值变低。使用在线净化柱后，分析物具有基质增强或抑制作用，但明显优于未使用在线净化柱，且经过在线净化柱后，所有化合物的线性相关系数均有提高，说明在线净化柱具有一定的净化效果。由于6种分析物斜率的比值大部分高于1.2或低于0.8，表明未能完全消除基质效应影响，所以实验采用基质匹配曲线来校正结果。

表3 鸡蛋基质溶液使用净化柱与未使用净化柱的净化效果对比

2.5 回收率、精密度及定量下限

在优化条件下，选择1，5，10 μg/kg 3个浓度水平进行加标回收率实验，每个加标水平平行6个样品，得方法回收率为71.9%～109.0%，相对标准偏差(RSD)为1.5%～14.9%(见表4)。

表4 方法回收率和相对标准偏差(n=6)

计算得方法的定量下限(LOQ，S/N=10)为1 μg/kg，可满足我国对聚醚类抗生素所规定的最大残留限量的测定要求。以牛奶样品为例，图2为空白牛奶样品加标1 μg/kg聚醚类抗生素的MRM色谱图，说明该方法能够准确地检测动物源性食品中的6种聚醚类抗生素。

2.6 实际样品的测定

将该方法用于28份样品的日常检测，1份鸡肉样品中检出马杜霉素，其含量为5±0.5 μg/kg(n=3)，低于我国规定的动物源性食品中聚醚类抗生素的最高残留限量。

3 结 论

本文建立了基于TurboFlow在线净化技术对动物源性食品中聚醚类抗生素的检测方法，满足了国内外对该类物质的检测要求。方法快速，仅需13 min，极大地节约了前处理时间，自动化程度高，净化柱能够重复使用(高于1 000针)，有利于大批量样品的处理，保证了方法的稳定性及准确性。

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Rapid Determination of Polyether Antibiotics Residues in Animal-originated Foodstuffs Using TurboFlow On-line Clean-up Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CAO Ya-qing1， SONG Ge2， WANG Man-man1， WANG Xue-sheng1*， AI Lian-feng2*

(1.School of Public Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China；2. Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantion Bureau，Shijiazhuang 050000，China )

A new method using TurboFlow online cleanup combined with tandem mass spectrometry was developed for the rapid and simultaneous determination of six polyether antibiotics residues,e.g.lasalocid,salinomicin,monensin,narasin,maduramycin and nigericin in animal-originated foods of animal origin.The milk，chicken and egg samples were extracted with acetonitrile，and the extracts were purified on a Cyclone-p column.After being eluted from the clean-up column，the analytes were separated on a Thermo Scientific Hypersil-Gold C8(150 mm×2.1 mm，5 μm) column and detected by electrospray mass spectrometry in positive ionization mode with multiple reaction monitoring.Under the optimized conditions，the linear ranges of six polyether antibiotics were in the range of 1-100 μg/L with correlation coefficients higher than 0.999.The limits of quantitation(LOQ) for all samples were 1 μg/kg.The recoveries from milk，chicken and egg samples were in the range of 71.9%-109.0% with relative standard deviations of 1.5%-14.9%.Key words：TurboFlow on-line cleanup；liquid chromatography-tandem mass spectrometry；polyether antibiotics；animal-originated foodstuffs

2016-03-17；

2016-04-07

国家自然科学基金项目(21305028)；河北省自然科学基金项目(B2013209238，H2016209018)；河北省教育厅自然科学项目(Q2012155)；国家质检总局项目(2013IK154，2014IK092)

研究简报

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.009

O657.63;O616.73

A

1004-4957(2016)10-1273-05

*通讯作者：王学生，硕士，教授，研究方向：卫生化学，Tel：0315-2592086，E-mail：xswang64@163.com

艾连峰，博士，研究方向：食品安全，Tel：0311-85980745，E-mail：ai_lianfeng@126.com