bFGF和MRP-1在胃癌中的表达及意义

谢家泰 曾志荣



bFGF和MRP-1在胃癌中的表达及意义

谢家泰1曾志荣2

目的 研究胃癌(GC)组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和多重耐药蛋白1(MRP-1)的表达规律及其相互关系。方法 用免疫组织化学染色(SP法)检测慢性浅表性胃炎(CSG)25例、胃黏膜肠上皮化生(IM)45例、异型增生(Dys)50例和GC 65例组织标本中bFGF、MRP-1阳性表达情况。RT-PCR技术检测MRP-1mRNA的表达情况。均数的比较采用t检验，两样本率的比较用χ2检验，两因素的相关分析用直线相关分析。结果 在CSG→IM→Dys→GC的过程中，bFGF，MRP-1的表达呈逐步递增趋势，bFGF，MRP-1的阳性表达率GC组与Dys组、IM组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。MRP-1与MRP-1mRNA表达强度呈正相关(r=0.598,P<0.05)。结论 胃癌形成过程中，bFGF，MRP-1，MRP-1mRNA表达逐渐上调。

胃癌 免疫组织化学染色 碱性成纤维细胞生长因子 多耐药相关蛋白1 逆转录-聚合酶链反应

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，死亡率位居第二位[1，2],其发病机理仍未完全阐明，中晚期患者治疗效果欠理想。胃癌的生长分化受很多因素调控，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能促进内皮细胞增殖，在肿瘤生长和转移中起重要作用。化疗是胃癌治疗的主要方法之一，能够减缓胃癌患者肿瘤细胞的繁殖，降低术后局部复发率及转移率，但胃癌细胞对化疗的敏感程度不一，化疗耐药是治疗失败的重要原因。多重耐药蛋白(MRP)介导的多重耐药是非常重要的耐药机制，其中MRP-1最为重要。本研究用免疫组化染色、RT-PCR技术分析慢性浅表性胃炎(CSG)、肠上皮化生(IM)、异型增生(Dys)和胃癌(GC)中MRP-1，MRP-1 mRNA和bFGF的表达，以探讨MRP-1，bFGF与胃癌生长转移的关系。

1.材料与方法

1.1 材料 收集2010年7月～2015年12月存档石蜡标本90例、术后新鲜标本95例，共185例，其中CSG 25例，IM 45例，Dys 50例，GC 65例为手术切除胃癌标本，按WHO肿瘤国际组织学新分类标准，GC组低分化23例，高中分化42例；CSG组为对照组。鼠抗人MRP-1 mAb，兔抗人bFGF rAb，免疫组织化学UltraSensitiveTMS-P试剂盒(Kit-9720)购自福州迈新生物技术开发有限公司；引物、TRIZOLTM试剂购自TaKaRa大连公司；RT-PCR试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

1.2 方法 石蜡包埋病理标本切片厚度4～5μm,采用免疫组织化学(SP法)方法按说明书步骤染色,以PBS替代一抗作为阴性对照,阳性对照为迈新公司提供的阳性对照片；取出新鲜标本后,立即置于装有液氮的保温杯中保存,提取各组织总RNA，按说明书进行RT-PCR检测。

光学显微镜下每张组织切片摄取10个高倍视野,输入DEIAS-2000P病理图文分析系统，计数阳性细胞,后计算其阳性表达率。细胞无阳性染色为阴性，有阳性染色为阳性。取10μl RT-PCR反应终产物，用1.2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶分析系统观察、分析电泳结果；检测目的基因和GAPDH的积分吸光度(A)值，计算二者的比值，得出各自mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对本文的数据进行分析处理，两样本均数比较用t检验，两样本率的比较用χ2检验，两因素相关分析用直线相关分析(Pearson相关系数)，取α=0.05，P<0.05为差异具有显著性。

2.结果

2.1 慢性浅表性胃炎、肠上皮化生、非典型增生和胃癌中bFGF，MRP-1的表达 bFGF阳性染色见于胞浆(图1)，bFGF表达阳性在CSG2例、IM5例、Dys16例和GC33例，GC组与Dys组、IM组比较差异显著(χ2值分别为13.001，4.802，P<0.05)。MRP-1阳性染色见于胞浆为棕黄色(图2),MRP-l表达阳性在CSG 1例、IM5例、Dys17例和GC43例，GC组与Dys组、IM组比较均具有统计学意义(χ2值分别为5.113,16.305，P<0.05)。

图1 bFGF的表达:A：CSG(x200):B:IM(x400):C:Dys(x400)):D:GC(x400)

图2 MRP-1的表达:A：CSG(x200):B:IM(x200):C:Dys(x400)):D:GC(x400)

2.2 不同胃黏膜组织MRP-1 mRNA量的变化 RT-PCR显示第1～3组的MRP-1 mRNA量显著高于第4～8组(P<0.01)，从第4组到8组MRP-1mRNA量逐渐减少(图3)，而高分化组明显高于中低分化组(t=3.151，3.556，P<0.01)。各组内MRP-1αmRNA相对表达量见表1、图3。

注：M—Marker，1—低分化GC组，2—中分化GC组，3—高分化GC组，4—高度Dys组，5—轻度Dys组，6—高度IM，7—轻度IM组，8—CSG组。图3 不同胃黏膜组织MRP-1mRNA变化

组别MRP⁃1mRNA1组060±0032组067±0033组095±0064组013±0025组012±0036组013±0027组008±0028组008±001

2.3 胃癌组织中bFGF与MRP-1表达的关系 见表2。

表2 bFGF与MRP-1在胃癌中阳性表达的相关性

注：χ2=2.698，P>0.05，Pearson相关分析r=0.756P<0.01。

2.4 bFGF、MRP-1表达与胃癌临床病理关系 见表3。

表3 临床病理参数与胃癌bFGF、MRP-1蛋白表达的关系

注：表中的P值为各组内的比较值。

3.讨论

3.1 癌细胞发生、发展和转移有赖于新生血管的生成。bFGF是一种强有力的血管生成正性调控因子，与肿瘤的血管生成、浸润转移及不良预后关系密切。它对肿瘤的作用机理是作为肿瘤自泌生长因子，促进生成肿瘤形成所必需的血管。相关研究显示[3，4]，有些肿瘤细胞通过自分泌或旁分泌bFGF而加速肿瘤血管生成和促进内皮细胞增生。但是新生血管基底膜不完整，细胞发育不成熟，常形成裂隙，为肿瘤的浸润转移创造了条件，同时新生血管为肿瘤细胞提供了营养，癌细胞生长加速，促进了肿瘤细胞的浸润转移。

本研究中发现bFGF在CSG中表达率为4%,IM中表达率为11.1%，两者差异有统计学意义(P<0.05)，bFGF在Dys中阳性率为32.0%，与CSG间比较,差异有统计学意义(P<0.01);bFGF表达在CSG与Dys，Dys与GC(阳性率为50.8%)之间差异有统计学意义(P<0.05)。这表明bFGF高表达与胃癌的发生发展相关。本研究显示bFGF与肿瘤的分期、分化程度及转移相关,但与患者的年龄、性别及肿瘤大小无关，这表明bFGF不仅参与了胃癌发生，而且可能与癌细胞的浸润能力增强、癌细胞进入血管或淋巴管并形成远处转移相关，提示bFGF对胃癌患者的生物学行为产生一定影响，可作为预测胃癌发展、浸润及转移的新肿瘤标志物。

3.2 化疗是目前肿瘤治疗的主要方法之一，但是由于耐药现象的普遍存在，成为肿瘤化疗的主要障碍，极大地阻碍了化疗的效果。相关研究提示恶性肿瘤耐药的产生，不仅需要肿瘤细胞克服自身产生的耐药机制，也需要改变机体的抗肿瘤免疫效应[5]，两者相辅相成，尤其是继发性耐药，药物化疗作后肿瘤细胞与免疫系统如何相互作用，以致耐药性产生，是当前肿瘤领域研究的热点[6～8]。

MRP-1基因是肿瘤多耐药途径的最为重要的基因，可将化疗药物泵出胞外以致多耐药产生，其耐药机制可能是随着化疗次数的增加和疗程的延长肿瘤细胞内MRP-1基因过表达或肿瘤细胞本身存在MRP-1基因过表达，把化疗药物泵出细胞外，导致耐药性产生[9，10]。也可能是改变了细胞浆及细胞器的pH值，减少药物到达其作用部位的浓度，并逆浓度梯度把胞内药物转运到胞外而导致耐药。本研究显示胃癌中MRP-1蛋白和MRP-1m RNA含量较CSG，IM，Dys明显增高(P<0.05)，提示胃癌细胞经化疗选择后MRP-1表达上调或通过自身改变而产生了耐药。本研究也显示，MRP-1和MRP-1 mRNA在胃高分化腺癌中的表达高于胃中低分化腺癌，表明高分化腺癌比低分化腺癌更易产生耐药性，与临床胃中低分化腺癌药物化疗效果较好而高分化腺癌化疗效果较差相符合。本研究显示MRP-1的表达与年龄、性别、肿瘤大小无关，但与肿瘤的临床分期有关，说明胃癌耐药现象与患者年龄、性别、肿瘤大小无关，耐药现象在早期较中晚期少见。

本实验结果显示，肿瘤组织中MRP-1表达率明显增加,故MRP-1的检测有助于化疗药物的选择。临床上制订化疗方案前，可先测定MRP-1的表达与否，避开MRP-1耐药谱中的药物，或采取一定措施来减少甚至逆转MRP-1的表达。

3.3 胃癌的发生、发展、转移与多因素、多基因相关，除传统耐药机制外,多耐药尚与肿瘤血管生成有关。有研究表明MRP-1能促进bFGF分泌,肿瘤血管生成常与肿瘤大小不相吻合,肿瘤细胞常处于相对缺氧及营养缺乏状态，缺氧不但使肿瘤细胞基因的不稳定性增加,诱导基因扩增，使多种蛋白表达改变，导致肿瘤细胞耐药；而且诱导bFGF表达,增加血管形成,亦促使肿瘤产生针对化疗药物的保护蛋白,从而增加抵抗化疗的能力。本实验结果显示：bFGF与MRP-1共表达相关,提示血管生成因子可能参与胃癌多药耐药的形成。

总之，我们的结果表明：bFGF与MRP-1之间具有一定的相关性，可能共同参与肿瘤多药耐药的形成。抑制血管生成和逆转多耐药蛋白表达相结合有可能成为治疗对化疗药物耐药的难治性肿瘤的有效途径，值得进一步深入研究。

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Expression and significance of bFGF and MRP-1 in gastric cancer

(XIE Jiatai1, ZENG Zhirong2.

1. Department of gastroenterology, Sanming first hospital affiliated to Fujian medical university, Sanming 365000; 2. Department of gastroenterology,the first affiliated hospital of Sun Yat-sen university, Guangzhou 510700, China.)

Objectives To study the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and multidrug resistance protein 1 (MRP-1) in gastric cancer (GC) tissue and their relationship.Methods immunohistochemical staining (SP method) detecting the patients on chronic superficial gastritis(CSG) 25 cases，Intestinal metaplasia(IM) 45 cases，50 cases of dysplasia (dys) and positive expression of 65 cases GC tissue specimens in bFGF and MRP-1.RT-PCR technology to detect the expression of MRP-1mRNA.The mean compared with t-test，the sample was compared withχ2-test，linear correlation analysis with correlation analysis of two factors.Results In the process of CSG，IM，Dys，GC，bFGF，MRP-1 expression was gradually increasing，bFGF，MRP-1 positive expression rate of GC group to Dys，IM group，the difference was statistically significant (P<0.05).MRP-1 expression intensity was positively correlated with MRP-1mRNA (r=0.598，P<0.05).Conclusions bFGF，MRP-1，MRP-1mRNA expression was gradually increased during the formation of gastric cancer.

gastric cancer, immunohistochemistry, bFGF, MRP-1, RT-PCR

1.福建医科大学附属三明第一医院 消化内科 365000 2.中山大学附属第一医院 消化科 510700

10.3969/j.issn.1672-4860.2016.05.004

2016-7-17