阿尔茨海默病和老年糖尿病患者的尿组蛋白变化及共病机制

周静波 梅少平 王 勇 倪嘉缵 宋达琳，4※



※为通讯作者

阿尔茨海默病和老年糖尿病患者的尿组蛋白变化及共病机制

周静波1梅少平2王 勇3倪嘉缵3宋达琳1，4※

目的 探讨阿尔茨海默病与老年2型糖尿病患者尿液中组蛋白的变化及其机制。方法 对22例正常人、20例T2DM患者和20例AD患者的尿液标本进行多肽的富集，然后采用多肽组学分析技术进行检测并使用ProteinPilot软件(v4.5)对获得的数据进行检索比对分析，从而确定相应蛋白质的种类。结果 与正常对照组相比AD组与T2DM组尿液中组蛋白H2B、组蛋白H2A、组蛋白H4显著增加。结论 炎症机制可能导致AD与T2DM患者尿液中组蛋白含量增加。

阿尔茨海默病 老年2型糖尿病 尿液 多肽谱 组蛋白

自20世纪90年代鹿特丹流行病学调查研究开始2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)间的相关性研究受到学者们的关注[1]，且随着研究的进展，越来越多的证据显示T2DM是AD的高危因素[2]。近年来，组蛋白不仅被证实与学习和记忆过程有关，而且与动脉粥样硬化性疾病也存在相关性。记忆的进行性减退是AD的特异性表现之一，同时血管的粥样硬化是DM的病理生理基础，然而组蛋白是否在两者的发病过程中起到了一定作用尚未达成一致意见。本实验采用多肽组学方法对健康组、T2DM组及AD组尿液中的多肽进行定性分析，探讨AD与老年T2DM患者尿中组蛋白含量的变化及两者的共病机制。

1.材料与方法

1.1 材料 选取2015年1月1日至2015年10月30日到青岛市市立医院体检的健康人22例、到青岛市市立医院老年内科住院的T2DM患者20例和AD患者20例。对照组：空腹血糖为3.9～6.1mmol/L且口服葡萄糖耐量试验(OGTT)显示餐后2h血糖<11.1mmol/L，无认知功能障碍；T2DM患者：已明确诊断为T2DM，且未合并糖尿病并发症；AD患者：已明确诊断为AD，未合并糖尿病。排除标准：高血压、冠心病、脑卒中、脑血管病变、头部外伤、帕金森综合征。全部患者均签署知情同意书，研究方案经我院伦理委员会讨论通过。

1.2 设备与材料 离心机；振荡器；镧-石墨烯磁性材料的水分散液：(30mg/ml)；真空冷冻干燥机；洗脱液:80%ACN含1%TFA；液相色谱流动液：A液(0.1%甲酸/2%乙腈/98%水溶液)；B液(0.1%甲酸/2%水/98%乙腈溶液)；分析柱:75μm×15cm，C18-3μm 120Å;捕集柱:3μm，120ÅEksigentnano LC-UltraTM2D液相色谱——TripleTOF 5600质谱联用仪；OLYMPUS AU1000/2700全自动生化仪。

1.3 标本的采集 用无菌瓶留取健康者、T2DM患者和AD患者的空腹清洁中段晨尿5～10ml，2小时之内放入-80℃的冰箱中保存备用。

1.4 尿液中多肽的富集 ①将已保存的一健康者的尿液标本取出、室温解冻，于4℃，12000rpm条件下离心10分钟后吸取上清于另一洁净EP管中，记为A；②按尿液:材料=50:1的比例向A中加入镧-石墨烯磁性材料的水分散液，2000rmp/min涡旋10分钟；然后1000rpm离心5分钟，取其沉淀，记为B；③加500μl水于B中，1000rmp/min涡旋10分钟，1000rpm离心5分钟，所得标本弃上清，对应沉淀重复本步操作2次，最终所得样本记为C；④加20μl洗脱液于C中，2000rmp/min涡旋10分钟，1000rpm离心10分钟，将所得上清移至另一EP管中，记为D；⑤将D于12000rpm离心10分钟，弃上清，用封口膜封口，在封口膜上扎相当数量的小孔，将标本置于真空冷冻干燥机中冻干，记为E。

1.5 在线反相液相色谱分离和串联质谱分析 将标本E重新溶解于0.1%甲酸/2%乙腈/98%的溶液中，取样品约2μg上样到纳升流量捕集柱上，以A液进行脱盐处理10分钟，然后以B液进行洗脱，同时对样品进行质谱扫描分析。

1.6 数据库检索鉴定及蛋白质分析 获得的原始质谱图导入到ProteinPilot软件(v4.5)中进行相应的数据库检索比对分析，进而确定对应的蛋白质。

1.7 血清学检测 于采集受试者尿液标本的次日清晨采集其空腹血液标本，应用氧化酶法对其甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)及血糖水平进行检测。

1.8 统计学方法 使用PASWStatistics18软件建立数据库和统计分析，多组间比较符合正态分布、方差齐的数据用方差分析的方法计算，偏态分布的资料用Kruskal-Wallis检验的方法计算；如多组间的比较有统计学意义再用Bonfeeroni法确定各组间是否存在统计学差异。设定P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 三组相应的临床各参数 见表1，年龄、性别、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，T2DM组与对照组、T2DM组与AD组间的血糖水平分别存在显著差异(P<0.05)。

2.2 AD组与T2DM组尿液中组蛋白H2B、组蛋白H2A、组蛋白H4显著增加。图1给出了一测试者尿液质谱图片段。

图1 测试者尿液质谱图片段

临床参数正常对照组(n=22例)T2DM组(n=20例)AD组(n=20例)F/HP年龄(岁)7014±14147190±7127120±835211>005男/女(例)12/1012/811/9105>005BMI(kg/m2)2400(199～281)2485(213～284)235(190～280)121>005SBP(mmHg)131(122～140)136(122～150)131(120～142)024>005DBP(mmHg)775(65～90)800(65～95)790(63～95)067>005TG(mmol/L)134±087187±038140±074182>005HDL(mmol/L)135±007121±006116±008166>005LDL(mmol/L)403±069362±082412±065245>005FPG(mmol/L)597±07389±079657±081708<005

注：T2DM组与对照组、T2DM组与AD组间的血糖水平分别存在显著差异(P<0.017)，对照组与AD组间血糖水平的差异无统计学意义。

3.讨论

组蛋白共有5种亚型即组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3和组蛋白H4，本实验检测到AD患者与T2DM患者尿液中组蛋白H2B、组蛋白H2A、组蛋白H4含量均显著增加。目前公认的组蛋白的主要作用是参与核小体的构成，维持染色体结构的稳定性。然而随着研究的深入，组蛋白的作用正越来越多地被认识到。

Silva等[3]的研究揭示组蛋白与学习和记忆紧密相关，该研究显示组蛋白的乙酰化修饰可激活学习和记忆形成相关基因的转录，增加突触的形成，从而促进学习和记忆过程，相反组蛋白的去乙酰化则会抑制记忆的形成。组蛋白的乙酰化过程受乙酰化酶和去乙酰化酶的双重调控。研究发现AD患者脑内组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)的表达增加、组蛋白乙酰化水平降低[4]；另一方面细胞核内的HDAC6可通过与Tau蛋白相互作用，调节Tau蛋白磷酸化过程，促进磷酸化的Tau蛋白形成，进而形成纤维缠结参与AD的发病[5]。此外组蛋白也可参与炎症反应，一方面通过NLRP3途径， 促进炎症因子的释放、招募中性粒细胞[6]，另一方面可作为中性粒细胞胞外诱捕网的主要成分被释放到细胞外调节免疫系统，加重炎症反应[7]。Friggeri等[8]证实，组蛋白H3、H4在体内实验和体外实验中均能减弱单核吞噬细胞对凋亡细胞的摄取和清除作用，进而加强炎症反应。Pemberton等[9]发现组蛋白可以使低密度脂蛋白在血管内沉积，可能是动脉粥样硬化的前期改变。该发现或许为解释DM患者体内血管病变提供了新思路。

综上所述，组蛋白可能参与了AD患者与T2DM患者的发病，炎症机制可能导致AD与T2DM患者尿液中组蛋白含量增加。但目前相关研究也较少，确切的结论有待于进一步研究。

1 Ott A，Stolk RP，van Harskamp F，et al.Diabetes mellitus and the risk of dementia: The Rotterdam Study[J].Neurology，1999，53(9): 1937-1942.

2 Alzheimer’s Disease International.Alzheimer’s disease International world Alzheimer report 2010; The Global Economic Impact of Dementia[R].London: Alzheimer’s disease International，2010:1-56.

3 Silva PF，Garcia VA，Domelles Ada S，et al.Memory impairment induced by brain iron overload is accompanied by reduced H3K9 acetylation and ameliorated by sodium butyrate[J].Neuroscience，2012，200: 42-49.

4 Fischer A，Sananbenesi F，Mungenast A，et al.Targeting the correct HDAC(s) to treat cognitive disorders[J].Trends Pharmacol Sci，2010，31(12):605-617.

5 Perez M，Santa-Maria I，Gomez de Barreda E，et al.Tau-an inhibitor of deacetylase HDAC6 function[J].J Neurochemn，2009，109(6):1755-1766.

6 Huang H，Chen HW，Evankovich J，et al.Histones Activate the NLRP3 Inflammasome in Kupffer Cells during Sterile Inflammatory Liver Injury [J].J Immunol，2013,191(5):2665-2679.

7 Fuchs TA，Brill A，Duerschmied D，et al.Extracellular DNA traps promote thrombosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(36): 15880-15885.

8 Friggeri A，Banerjee S，Xie N，et al.Extracellular histones inhibit efferocytosis[J].Mol Med，2012，18:825-833.

9 Pemberton AD，Brown JK.In vitro interactions of extracellular histones with LDL suggest a potential pro-atherogenic role [J].PLoS ONE，2010，5(3):e9884.

The level of histone in urine of patients with Alzheimer’s disease or elderly patients with type 2 diabetes mellitus

(ZHOU Jingbo1, MEI Shaoping2, WANG Yong3, NI Jiazuan3, SOND Dalin1,4.

1. Qingdao university 266071; 2. The hospital of Qingdao University, Qingdao 266071; 3. Shenzhen key laboratory of microbial genetic engineering, Shenzhen 518000; 4. Qingdao municipal hospital, Qingdao 266071, China.)

Objectives By investigate the level of histone in urine of patients with Alzheimer’s disease (AD) or elderly patients with type 2 diabetes mellitus ( T2DM) to seek whether there has common pathogenesis between AD and T2DM.Methods The urine samples obtained from 22 healthy individuals and 20 patients with T2DM and 20 patients with AD.The protein were analyzed by mass spectrometry after enrichment using weak cationic-exchange magnetic beads.Then the datum were analyzed by proteinPilot(V.4.5) to determine the type of the protein.Results Compared with normal control group，the significant increased protein are histone H2B，histone H2A and histone H4 in both of AD and T2DM patients.Conclusions Histone deacetylases and inflammation may have an effect on the high level of histone in urine.

Alzheimer’s Disease, Type 2 Diabetes Mellitus, Elderly, Protein and Peptide Analysis, Urine, Histone

1.青岛大学 266071 2.青岛大学附属医院 266071 3.深圳大学生命科学学院 518000 4.青岛市市立医院 266071

青岛市科技支撑项目12-1-4-16-(1)-jch

10.3969/j.issn.1672-4860.2016.05.018

2016-8-20