Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠血清抗角蛋白抗体和抗环瓜氨酸肽抗体及类风湿因子的检测分析

罗德梅，李文红，王 倩，杜文静，孟 岩，李慧君，闫 怡，冯 宁，马秀敏，罗 莉



·论著·

Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠血清抗角蛋白抗体和抗环瓜氨酸肽抗体及类风湿因子的检测分析

罗德梅，李文红，王 倩，杜文静，孟 岩，李慧君，闫 怡，冯 宁，马秀敏，罗 莉

目的对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠血清抗角蛋白抗体(AKA)、抗环瓜氨酸肽(Anti-CCP)抗体及类风湿因子(RF)进行检测，并分析其与人类类风湿关节炎(RA)的血清免疫学是否相似。方法2014年11月—2015年3月，15只SPF级7～8周健康雌性Wistar大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法选取5只作为空白对照组，10只用于建立CIA模型，最终8只造模成功(CIA模型组)。造模成功后，采集CIA模型组和空白对照组大鼠股动脉血，常规分离血清，分别采用间接免疫荧光(IIF)法检测两组大鼠血清AKA，酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测Anti-CCP抗体和RF-IgM抗体；分离膝关节滑膜，用40 g/L多聚甲醛固定作为病理标本，进行HE染色。结果CIA模型组大鼠血清AKA阳性5例，空白对照组均阴性。空白对照组和CIA模型组大鼠血清Anti-CCP抗体及RF-IgM抗体水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。空白对照组大鼠关节滑膜病理HE染色可见滑膜细胞排列清晰，组织学结构正常，未见增生，无明显炎性细胞聚集和浸润；CIA模型组大鼠关节滑膜病理HE染色可见滑膜细胞排列紊乱，毛细血管增生，滑膜增生明显，滑膜下大量炎性细胞浸润。结论CIA大鼠血清中出现AKA阳性，与人类RA的血清免疫学类似，适用于RA的基础研究。

关节炎,类风湿；大鼠,Wistar；类风湿因子；抗角蛋白抗体；抗环瓜氨酸肽抗体

罗德梅，李文红，王倩，等.Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠血清抗角蛋白抗体和抗环瓜氨酸肽抗体及类风湿因子的检测分析[J].中国全科医学，2016，19(27)：3287-3290.[www.chinagp.net]

LUO D M,LI W H,WANG Q,et al.Detection analysis of serum anti-keratin antibody,anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor in rats with type Ⅱ collagen-induced arthritis[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3287-3290.

类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病(AID)，以关节滑膜、软骨损害为主要表现，早期常表现为对称性多关节肿痛，病情反复后逐渐进展为关节畸形、关节功能丧失，从而严重影响患者的生活质量[1]。大量研究证实，在RA的发病过程中，多种细胞因子及炎性递质共同参与其中，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、滑膜细胞、各种细胞因子及胶原酶等[2]；T淋巴细胞活化的同时又激活了B淋巴细胞，使其转化为浆细胞，产生抗角蛋白抗体(AKA)、抗环瓜氨酸肽 (Anti-CCP) 抗体、类风湿因子(RF)等。本实验对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(typeⅡcollagen induced arthritis，CIA)模型大鼠血清中AKA、Anti-CCP抗体、RF-IgM抗体进行检测，并分析其免疫特点和人类RA是否相似。

1　材料与方法

1.1实验动物2014年11月—2015年3月，SPF级7～8周健康雌性Wistar大鼠15只，体质量(180±20)g，由新疆医科大学动物实验中心提供。实验期间由新疆医科大学第一附属医院实验动物科学研究部进行饲养。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠模型的建立15只大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法选取5只作为空白对照组，其余10只用于建立CIA模型(CIA造模组)。造模过程：参照文献[3]方法，将牛Ⅱ型胶原(美国SIGMA公司)溶于提前预冷的0.1 mol/L的冰乙酸溶液中，最终浓度为 4 mg/ml，4 ℃过夜；将等体积的完全弗氏佐剂加入牛Ⅱ型胶原冰乙酸溶液中，在冰浴条件下使二者充分乳化；于大鼠左足跖肉垫及尾根部多点皮内注射牛Ⅱ型胶原乳剂(0.2 ml/只)进行初次免疫。空白对照组5只大鼠则在大鼠左足跖肉垫及尾根部进行多点皮内注射0.9%氯化钠溶液(0.2 ml/只)。初次免疫后第8天，使用上述乳剂于CIA造模组大鼠左足跖肉垫及尾根部再次加强免疫；空白对照组仍在大鼠左足跖肉垫及尾根部进行多点皮内注射0.9%氯化钠溶液(0.2 ml/只)。每日用游标卡尺记录两组大鼠左足踝关节肿胀情况。

自初次免疫后，每周参照关节炎症指数(AI)[3]对两组大鼠进行评分，直至第3周末。AI评分具体操作如下：依据大鼠关节炎表现分为0～4分，0 分即无关节炎症状，1 分为单个爪或趾(指)红肿，2 分为2个关节受累，3 分为2 个以上关节受累，4 分为爪和趾(指)均发生严重关节炎。每只大鼠AI评分为4只包括趾(指)在内的整个爪评分之和。初次免疫后第3周末，AI评分≥6分提示造模成功，可用于实验[3]。剔除未发病的2只大鼠，剩余8只大鼠AI评分均≥6分，造模成功(CIA模型组)。空白对照组5只大鼠均未出现关节肿胀表现。

1.2.2检测指标造模成功后，两组大鼠均以10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g 腹腔麻醉，采集股动脉血，常规分离血清。AKA(1∶10)的检测采用间接免疫荧光(IIF)法，以大鼠食管中1/3冷冻切片为底物，以局限于角质层板层状、线状荧光为阳性，AKA试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司。Anti-CCP抗体和RF-IgM抗体的检测采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法，Anti-CCP抗体试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司，RF-IgM抗体试剂盒购自加拿大Hermes Criterion Biotechnology公司。均严格按照说明书步骤进行操作。分离膝关节滑膜，用40 g/L多聚甲醛固定作为病理标本，采用荧光显微镜(EUROStarⅡ，addcare2000全自动酶免分析仪)观察HE染色结果。

2　结果

2.1AI评分结果CIA模型组初次免疫后第2周末部分大鼠出现左足踝及足跖关节肿胀，第3周末上述关节肿胀程度加重，足跖呈鼓槌样，无法负重，AI评分均≥6分；空白对照组大鼠未出现关节肿胀表现，AI评分均为0分(见图1)。

注：CIA=Ⅱ型胶原诱导性关节炎，AI=关节炎症指数

图1两组大鼠AI评分

Figure 1AI score of rat in two groups

2.2AKA、Anti-CCP抗体及RF-IgM抗体检测结果CIA模型组大鼠AKA阳性5例，空白对照组均阴性(见图2，本文图2、3彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。空白对照组和CIA模型组大鼠血清Anti-CCP抗体、RF-IgM抗体均阴性。空白对照组和CIA模型组血清Anti-CCP抗体和RF-IgM抗体水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

Table 1Comparsion of serum Anti-CCP and RF-IgM antibody of rats between two groups

组别只数Anti-CCP抗体RF-IgM抗体空白对照组51.07±0.011.11±0.24CIA模型组81.06±0.032.61±0.51t值0.118.44P值0.360.71

注：CIA=Ⅱ型胶原诱导性关节炎，Anti-CCP=抗环瓜氨酸肽，RF=类风湿因子

图2　两组大鼠血清AKA间接免疫荧光结果(×400)

Figure 2Indirect immunofluorescence results of serum AKA of rats in two groups

2.3关节滑膜病理结果空白对照组大鼠关节滑膜病理HE染色可见滑膜细胞排列清晰，组织学结构正常，未见增生，无明显炎性细胞聚集和浸润；CIA模型组大鼠关节滑膜病理HE染色可见滑膜细胞排列紊乱，毛细血管增生，滑膜增生明显，滑膜下大量炎性细胞浸润(见图3)。

图3　两组大鼠关节滑膜病理结果(HE染色，×200)

3　讨论

RA是一种临床常见的自身免疫性疾病，病因尚未阐明。其主要发病机制是由T细胞介导的异常免疫反应，自身反应性T细胞活化后分泌细胞因子，辅助B细胞产生自身抗体，自身抗体的产生是自身免疫性疾病的特征性表现[4-5]。目前，研究RA疾病的动物模型包括佐剂性关节炎模型(ajudvant arthritis，AA)和CIA。AA虽然在制作上方便简单，可广泛应用于多种动物[6]，但其与RA有较大差异，病变具有自限性；CIA是由Ⅱ型胶原诱发的一种免疫性炎症模型，已被公认为是研究RA的经典动物模型。本研究对CIA模型组大鼠血清中AKA、Anti-CCP抗体和RF进行分析，探讨其与人类RA的血清免疫学是否类似。

3.1关节炎表现和HE染色本研究中，空白对照组5只大鼠均未出现关节肿胀表现；CIA模型组部分大鼠在初次免疫第 2周末出现后踝及足跖关节肿胀，第3周末上述关节肿胀程度加重，足跖呈鼓槌样，无法负重，AI评分≥6分；病理HE染色显示，空白对照组大鼠滑膜细胞排列清晰，组织学结构正常，未见增生，无明显炎性细胞的聚集和浸润，而CIA模型组关节滑膜增生明显，滑膜细胞排列紊乱，毛细血管增生，滑膜下大量炎性细胞浸润，说明造模成功。

3.2AKA、Anti-CCP抗体、RF-IgM抗体AKA是一种能与大鼠食管角质层反应的IgG抗体，有文献报道AKA对RA的诊断灵敏度较低，特异度较高[7]，被认为是RA最特异的生物学指标，并在RA早期甚至临床症状出现前即可出现。本研究中，CIA模型组大鼠血清中AKA阳性率为5/8，空白对照组大鼠血清AKA均阴性，与文献报道一致[7]。尽管RF是第一个公认的RA免疫标志物，对RA诊断的灵敏度为50%～90%，特异度为50%～95%，但Anti-CCP抗体的灵敏度、特异度在国内外均被肯定优于RF，其检测在动物模型中未见报道[8]。本研究CIA模型组大鼠血清中仅检测到Anti-CCP抗体和RF-IgM抗体低水平表达，未检测到Anti-CCP、RF-IgM抗体阳性。也有文献报道CIA模型中肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子的滴度升高，未检测到RF阳性[9]，本研究结果与其相似。考虑原因可能为本研究中CIA模型组大鼠关节滑膜虽有增生、滑膜细胞排列紊乱、滑膜下大量炎性细胞的浸润，但病变时间短，关节软骨的破坏程度尚轻，与文献报道的Anti-CCP抗体阳性者出现骨质破坏较阴性者严重[10]相符；也可能与Anti-CCP抗体是判断RA预后的免疫指标有关。

综上所述，CIA模型大鼠的免疫特点和人类RA较为相似，进一步证实CIA模型大鼠适用于RA的基础研究。但本研究纳入样本量较小，今后应扩大样本量进一步研究。

作者贡献：罗德梅进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；李文红进行资料收集；王倩、杜文静、孟岩、李慧君、闫怡、冯宁进行实验实施、评估、资料收集；马秀敏、罗莉进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：赵跃翠)

Detection Analysis of Serum Anti-Keratin Antibody,Anti-Cyclic Citrullinated Peptide Antibody and Rheumatoid Factor in Rats with Type Ⅱ Collagen-induced Arthritis

LUODe-mei,LIWen-hong,WANGQian,DUWen-jing,MENGYan,LIHui-jun,YANYi,FENGNing,MAXiu-min,LUOLi.

TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,ChinaCorrespondingauthor:MAXiu-min,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;E-mail:maxiumin1210@163.comLUOLi,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;E-mail:luoli.6@163.com

ObjectiveTo detect serum anti-keratin antibody (AKA),anti-cyclic citrullinated peptide (Anti-CCP) antibody and rheumatoid factor (RF) in rats type Ⅱ collagen-induced arthritis (CIA),and to analyze whether they are similar with serum immunology of human rheumatoid arthritis (RA).MethodsAfter one-week adaptive feed,among 15 healthy female Wistar rats (SPF level) aged 7 to 8 weeks,5 were selected as blank control group by random number table method,and 10 for building type Ⅱ CIA model from November 2014 to March 2015,and finally 8 rats′ modeling was successfully built(CIA model group).After successful modeling,femoral artery blood of rats in CIA model group and blank control group was collected,and serum was routinely separated,serum AKA of rats in two groups and Anti-CCP antibody and RF-IgM antibody were detected by indirect immunofluorescence (IIF) method and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method respectively;40 g/L paraformaldehyde fixation was used as pathological specimens to isolate synovium of knee joint.The pathological specimens were conducted with HE staining.ResultsSerum AKA of 5 cases (5/8) were positive in CIA model group,all were negative in blank control group.There was no significant difference in levels of serum Anti-CCP antibody and RF-IgM antibody between rats in blank control group and CIA model group (P>0.05).Pathological HE staining observation of joint synovium of rats in blank control group presented clear arrangement of synovial cells,normal histology structure,no hyperplasia,no significant accumulation and infiltration of inflammatory cells;pathological HE staining observation of joint synovium of rats in CIA model group showed disordered arrangement of synovial cells,capillary proliferation,significant synovial hyperplasia,synovial infiltration of large amount of inflammatory cells.ConclusionSerum of CIA rats group in shows positive AKA,which is similar with serum immunology of human RA,and suits for basic research of RA.

Arthritis,rheumatoid；Rats,Wistar；Rheumatoid factor；Anti-keratin antibody；Anti-cyclic citrullinated peptide antibody

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2014211C047)

830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院(罗德梅，王倩，杜文静，孟岩，冯宁，马秀敏，罗莉)；头屯河区中心医院(李文红)；新疆医科大学基础医学院(李慧君，闫怡)

马秀敏，830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院；E-mail：maxiumin1210@163.com

罗莉，830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院；E-mail：luoli.6@163.com

R 593.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.006

2016-02-10；

2016-07-15)