OA 患者滑膜IL-7R 的表达及临床诊断价值研究

武豪杰，张明辉，朱书涛，王晓

（河南大学淮河医院 骨科，河南 开封 475000）

0 引言

骨性关节炎（osteoarthritis OA）是骨科比较常见的疾病，是一种随着年龄的增长发病率明显增加的慢性进行性骨关节病，严重危害老年人的身体健康。根据世界卫生组织的统计显示，大于65 岁以上的人群中有50%以上都有膝关节骨性关节炎的临床表现[1]。目前膝关节骨性关节炎的主要治疗方法是早期采用止痛、保护、延缓软骨退化等非手术方法治疗，晚期软骨破坏严重需要进行关节清理及膝关节表面置换等手术治疗[2-3]。在漫长的保守治疗和手术治疗中会产生昂贵的治疗费用。目前对于膝关节骨性关节炎的基因治疗正成为世界研究的热点[4-5]。白介素-7 受体（IL-7R）属于I 型细胞因袭受体家族成员，IL-7R 是淋巴细胞增殖和分化过程中的必需因子，它在细胞表面的缺失会导致B 和T 淋巴细胞生成障碍[6]。最近的研究发现在类风湿关节炎患者免疫细胞表面，IL-7R 表达明显增加，阻断IL-7R可以明显减轻关节炎的严重程度[7-8]。目前关于IL-7R 与膝骨性关节炎的研究表明，阻断IL-7R 能够降低RANKL 的蛋白表达，抑制RANK/RANKL 信号途径，降低破骨细胞的形成和成熟，对软骨细胞也有一定影响[9-10]。本研究主要探讨膝关节骨性关节炎（OA）患者滑膜中IL-7R 基因的表达情况，对其临床诊断价值进行讨论，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

OA 组：选取我院骨科进行膝关节人工置换术患者41 例，年龄40-79 岁，平均（66.4±9.2）岁；对照组：选取我院骨科半月板损伤和交叉韧带损伤进行关节镜手术资料的患者36 例，年龄26-60岁，平均（38.1±11.3）岁。分别切取两组患者膝关节髌上囊的滑膜组织置于无菌管后直接放入液氮中，30min 后放入-80℃保存。膝关节骨性关节炎患者符合Kellgren-Lawrence 分级标准的Ⅲ级和Ⅳ级。

1.2 OA 诊断标准

膝痛、关节活动时出现骨响、年龄≥40 岁、晨僵时间≤30min、膝关节X 射线异常。患者经过手术后等到明确诊断。

1.3 排除标准

患者我其他血液系统、关节炎性、免疫系统以及全身系统性疾病。

1.4 实验方法

（1）基因芯片：取3 例新鲜正常的滑膜组织和10 例新鲜OA 患者的滑膜组织进行基因芯片检测。并用Real time RT-PCR 对基因芯片结果进行验证（委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行）。

（2）HE 染色、免疫组化实验：将滑膜组织置于4%的多聚甲醛溶液中，在4℃固定24h 后进行脱水和石蜡包埋。将所有的标本按4μm 规格切片后固定于载玻片。将固定好的样本进行HE 染色实验和免疫组化实验。免疫组化法：用3%的过氧化氢对内源性过氧化物酶进行封闭，加热抗原修复，10%正常羊血清孵育，加入一抗，置于4℃冰箱中过夜，用PBS 缓冲液振荡清洗（各30 min）后分别滴加二、三抗，DAB 显色，苏木素复染，常规封片。

（3）RT-PCR：引物设计：IL-7R引物序列为：5`-CTGTTGGACATCTCGGCCTGT-3`，3`-TATCGCACCTTCTGTAAGTTCG-5`；GAPDH 引物序列为：5`-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3`、3`-GCGACTCATCGAGCACCTC-5`。用Trizol 法对滑膜组织中的总RNA 进行提取，用Applied Biosystems逆转录试剂盒合成第一链cDNA，PCR 扩增IL-7R 基因片段后进行逆转录聚合酶链式反应。对77 例患者的髌上滑膜组织中的IL-7R 表达和膝关节骨关节炎中的IL-7R 基因的表达进行检测。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用（）表示，采用t检验，将P＜0.05判定为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基因芯片

基因芯片结果如图1 所示，共对22882 个基因进行了检测，其中上升表达基因450 个、下降表达基因809 个，IL-7R 基因在膝关节OA 滑膜组织中的表达比膝关节正常滑膜组织低。我们进行了Real Time PCR 分析以验证基因芯片的结果，结果表明IL-7R 在膝关节OA 滑膜组织中的表达显著低于正常的膝关节滑膜组织。

图1 基因芯片筛查结果

2.2 RT-PCR 分析

（1）组织总RNA 电泳结果：电泳结果显示RTPCR 具有良好的特异性，见图2。

图2 组织总RNA 电泳结果

（2）IL-7RmRNA 统计学分析：对膝关节OA 滑膜组织和正常滑膜组织中的IL-7RmRNA 相对表达量分析显示，IL-7RmRNA 在膝关节OA 滑膜组织中的表达量（0.13±0.55）显著低于正常的膝关节滑膜组织（0.93±0.12），P=0.001。

（3）RT-PCR 检测结果：RT-PCR 结果证实IL-7R在膝关节OA 滑膜组织中的表达显著低于膝关节正常滑膜组织，见图3。

图3 RT-PCR 检测结果

2.3 HE 染色结果

正常组和OA 组滑膜组织的HE 染色情况如图3 所示，对照组滑膜组织的HE 染色结果显示成纤维细胞整齐排列，可见较薄的滑膜衬里且细胞层数较少（图4-a）。OA 组的染色结果显示滑膜组织有类乳头样增生，可见较厚的滑膜衬里且细胞层数增多，还见有因增生而变大的巨噬细胞及成纤维细胞，此外滑膜的绒毛也变厚且部分出现纤维化（图4-b）。

图4 HE 染色结果

2.4 IL-7R 的免疫组化研究

对膝关节正常滑膜组织和OA 滑膜组织免疫组化研究结果显示IL-7R 主要在膝关节滑膜组织的细胞浆中表达，且OA 滑膜组织中IL-7R 的表达量显著低于正常滑膜组织，见图5。

图5 免疫组化研究结果

3 讨论

IL-7R 和膝关节OA 的关在国内报道较少，本研究以正常的膝关节滑膜组织和膝关节OA 滑膜组织作为研究对象，采用基因芯片对膝关节正常滑膜和OA滑膜进行了检测。通过基因芯片的筛查，我们发现IL-7R 基因在膝关节OA 滑膜组织中的表达比膝关节正常滑膜组织低。我们进行了Real Time RT-PCR 分析以进一步对基因芯片结果进行验证，结果证实了IL-7R 在膝关节OA 滑膜组织中的表达显著低于正常的膝关节滑膜组织。相比于传统PCR 定量分析方法，Real Time RT-PCR 能显著提高定量的准确度。传统的定量方法主要通过中点检测，通过对PCR 产物琼脂糖电泳条带进行光密度的扫描，其主要缺点在于结果准确性受PCR 平台期影响较大。而Real Time RT-PCR 能有效避免该问题，Real Time RT-PCR 能利用Ct 值和起始模板对数的线性关系进行定量，且具有很好重现性。

本研究通过使用HE 染色对膝关节正常滑膜组织和OA 滑膜组，结果显示膝关节正常滑膜组织的HE染色结果显示成纤维细胞整齐排列，可见较薄的滑膜衬里且细胞层数较少。OA 滑膜组织的染色结果显示滑膜组织有类乳头样增生，可见较厚的滑膜衬里且细胞层数增多，还见有因增生而变大的巨噬细胞及成纤维细胞，此外滑膜的绒毛也变厚且部分出现纤维化。免疫组化研究结果表明IL-7R 在滑膜细胞的细胞浆中表达，在膝关节OA 滑膜细胞中的表达量相对于正常膝关节滑膜细胞有明显下降。RT-PCR 进一步证实了该结果。以上实验结果证明了IL-7R 在膝关节正常滑膜组织和OA 滑膜组织中均有表达，但是在OA 滑膜组织中表达量相对降低。

有研究通过用IL-7R 对胶原诱导性关节模型进行治疗并取得了良好的治疗效果[11-12]。还有报道显示IL7 对Th1 和Th17 细胞有很强激活效应，但是IL7 对于Th2 细胞的激活作用则相对较弱。因此通过阻断IL-7R 能降低Th1 和Th17 细胞的细胞活性从而降低炎性因子IL-17 和干扰素-β 的表达[13-14]。还有研究证实了通过阻断IL-7R 能够有效RANKL 蛋白表达从而抑制了RANK/RANKL 信号通路，进而抑制了破骨细胞的生长，对软骨细胞也具有一定的影响[15]。

综上所述，IL-7R 在膝关节正常滑膜组织和OA滑膜组织中均有表达，但是在OA 滑膜组织中表达量相对降低。关于IL-7R 在治疗骨性关节炎的作用还有待进一步研究。

IL-7R 和膝关节OA 的关在国内报道较少，本研究以正常的膝关节滑膜组织和膝关节OA 滑膜组织作为研究对象，采用基因芯片对膝关节正常滑膜和OA滑膜进行了检测。通过基因芯片的筛查，我们发现IL-7R 基因在膝关节OA 滑膜组织中的表达比膝关节正常滑膜组织低。我们进行了Real Time RT-PCR 分析以进一步对基因芯片结果进行验证，结果证实了IL-7R 在膝关节OA 滑膜组织中的表达显著低于正常的膝关节滑膜组织。相比于传统PCR 定量分析方法，Real Time RT-PCR 能显著提高定量的准确度。传统的定量方法主要通过中点检测，通过对PCR 产物琼脂糖电泳条带进行光密度的扫描，其主要缺点在于结果准确性受PCR 平台期影响较大。而Real Time RT-PCR 能有效避免该问题，Real Time RT-PCR 能利用Ct 值和起始模板对数的线性关系进行定量，且具有很好重现性。

本研究通过使用HE 染色对膝关节正常滑膜组织和OA 滑膜组，结果显示膝关节正常滑膜组织的HE染色结果显示成纤维细胞整齐排列，可见较薄的滑膜衬里且细胞层数较少。OA 滑膜组织的染色结果显示滑膜组织有类乳头样增生，可见较厚的滑膜衬里且细胞层数增多，还见有因增生而变大的巨噬细胞及成纤维细胞，此外滑膜的绒毛也变厚且部分出现纤维化。免疫组化研究结果表明IL-7R 在滑膜细胞的细胞浆中表达，在膝关节OA 滑膜细胞中的表达量相对于正常膝关节滑膜细胞有明显下降。RT-PCR 进一步证实了该结果。以上实验结果证明了IL-7R 在膝关节正常滑膜组织和OA 滑膜组织中均有表达，但是在OA 滑膜组织中表达量相对降低。

有研究通过用IL-7R 对胶原诱导性关节模型进行治疗并取得了良好的治疗效果[11-12]。还有报道显示IL7 对Th1 和Th17 细胞有很强激活效应，但是IL7 对于Th2 细胞的激活作用则相对较弱。因此通过阻断IL-7R 能降低Th1 和Th17 细胞的细胞活性从而降低炎性因子IL-17 和干扰素-β 的表达[13-14]。还有研究证实了通过阻断IL-7R 能够有效RANKL 蛋白表达从而抑制了RANK/RANKL 信号通路，进而抑制了破骨细胞的生长，对软骨细胞也具有一定的影响[15]。

综上所述，IL-7R 在膝关节正常滑膜组织和OA滑膜组织中均有表达，但是在OA 滑膜组织中表达量相对降低。关于IL-7R 在治疗骨性关节炎的作用还有待进一步研究。