耐酒精酿酒酵母大气压等离子体诱变条件的建立及选育

方佩佩，王世清，李　静，熊旭波，谭海刚，刘晓莉

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266100）

耐酒精酿酒酵母大气压等离子体诱变条件的建立及选育

方佩佩，王世清，李静，熊旭波，谭海刚，刘晓莉

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266100）

酿酒酵母在酒类发酵过程中起着非常重要的作用，但普遍存在耐酒精能力弱、发酵速度慢等问题。本研究采用大气压等离子体技术对酿酒酵母进行诱变，以酵母菌株S1为出发菌株，以致死率和正突变率为指标，对酵母菌菌龄、酵母菌浓度、辐照电压、辐照时间、样品与等离子电极间距和氩气流速等影响大气压等离子诱变的因素进行研究，并通过TTC显色反应、耐酒精性能测定、遗传稳定性实验、糖类发酵实验、致死温度测定、耐高糖度测定、产酯能力测定等对突变酵母进行筛选。确立了酿酒酵母大气压等离子体诱变的最佳条件为：酵母菌菌龄为12 h、酵母菌浓度为106个/mL、辐照电压为165 V、辐照时间为14 min，样品与等离子电极间距为4 cm和氩气流速为1.0 L/h，最终筛选得到1株综合性能较强的突变酵母菌株S45。

大气压等离子体； 诱变； 酿酒酵母； 选育

在很早以前，我国自古就开始利用酵母菌发酵酿酒，目前酵母菌仍作为主要微生物进行乙醇发酵。作为与人类关系最为密切的微生物，酵母菌被广泛应用于葡萄酒、啤酒、蒸馏酒及燃料乙醇等行业［1］。不论是哪种发酵类型，降低生产成本、提高发酵产量是关键，高浓度发酵能够在单位时间和体积内提高发酵终产物的浓度，成为降低乙醇发酵成本的有效途径［2］。自然界中存在的酵母菌株在发酵过程中抗外界压力较小，发酵初期高浓度底物、高浓度乙醇产物等都会对酵母菌造成毒害，影响发酵产量［3-5］。同时，酵母菌的发酵产物中酯类物质的种类和产量对酒的口感、香味和稳定性有较大的影响。因此，对酵母菌株进行诱变，选育综合性能较强的酵母菌株具有重要意义。

传统的诱变技术有紫外、激光辐照、化学试剂、离子注入法等［6-7］，存在遗传稳定性差、诱变效率低、污染环境等问题，等离子体诱变技术具有突变频率高、诱变遗传稳定性好、快速、安全、无毒、无污染等特点，是一种新型诱变技术，能够产生羟基自由基、氧原子、臭氧和过氧化氢等活性氧（ROS）［8］，这些活性氧自由基是导致酵母菌损伤及死亡的重要原因之一［9-10］。等离子体能引起酵母细胞的氧化应激，导致胞内DNA和蛋白质损伤、基因的改变［11］，能够产生碱基缺失、染色体重复、倒位和易位等多种变异类型，诱变效率较高［8，12-13］。目前，等离子体诱变技术已经运用于海洋地衣芽孢杆菌、镍吸附细菌、谷氨酸棒杆菌、肺炎克雷伯氏菌等30多种生物的诱变选育［14-20］，但等离子体技术运用于酿酒酵母菌株，报道较少。

本研究采用大气压等离子体技术对酿酒酵母菌进行诱变，初步探究了大气压等离子技术诱变酿酒酵母菌的最佳条件，并对突变菌株进行筛选，得到了1株综合性能较强的优良酵母菌株。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

1.1.1材料及试剂

酿酒酵母S1（青岛农业大学微生物实验室保存酵母菌株）；色谱级甲醇、正丙醇、仲丁醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯等（北京京科瑞达科技有限公司）；蛋白胨、YPD培养基、PDA培养基、酵母浸粉等（青岛高科园海博生物科技有限公司）；α-淀粉酶、糖化酶（青岛生物技术有限责任公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2主要设备

等离子体设备（中国科学院等离子体物理研究所，图1）；气相色谱仪7890（上海天美仪器有限公司）；SBA-40E生物传感分析仪（山东省农科院生物研究所）；WFZ-2100型紫外可见分光光度计（龙尼柯仪器）；TB-214电子天平（DENVER INSTRUMENT）；XYOG02型高压蒸汽灭菌锅（新华医疗器械）；SW-CJ-2D无菌超洁净工作台（青岛正恒实验设备）；电热水浴锅（龙口先科仪器公司）；手持式折光仪（北京鹏程光学仪器有限公司）。

图1　大气压等离子体设备装置图

1.2实验方法

1.2.1酵母菌生长曲线的测定

挑取酵母菌落到YPD液体培养基中，于200 r/min的28℃恒温摇床上培养，每隔2 h取1次样，600 nm测吸光度（OD）值，以空白的YPD培养液为对照，根据所测得的吸光度值绘制酿酒酵母的生长曲线。

1.2.2大气压等离子体对酵母菌的诱变处理

挑取酵母单菌落到YPD液体培养基中，培养10 h，梯度稀释至106个/mL。取10 mL菌悬液于无菌平板中，保持辐照电压165 V、处理时间14 min、电极与样品间距4 cm、氩气流速1.0 L/h，对其进行诱变处理。

取0.1 mL处理后的菌悬液于YPD固体培养基上，涂布，并以未经处理的菌体为对照，28℃±1℃培养48 h，计算经大气压等离子处理后酵母菌的致死率。

从处理后的菌株中随机挑取20～30株菌株斜面保藏，并进行发酵实验，测量诱变前后菌株对酒精的耐受性，酒精耐受性变强的菌株即为正突变菌株，计算正突变率。

按以下公式计算致死率：

按以下公式计算正突变率：

1.2.3酵母菌对酒精耐受性的测定

配制不同酒精度9%vol、10%vol、11%vol、12%vol、13%vol、14%vol、15%vol、16%vol、17%vol、18%vol的麦芽汁培养基，将诱变后的菌株分别接种于不同酒精度的麦芽汁培养基中，采用杜氏导管法，恒温培养0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，观察并计算杜氏小管内产气及失重情况，选择产气快且产气量多的菌株。

1.2.4突变酵母菌株的筛选

1.2.4.1一级筛选

用大气压等离子体在最佳诱变条件下，对酿酒酵母菌进行批量处理，处理得到的菌悬液涂布于PDA固体培养基上，29℃±1℃培养2 d，将10 mL TTC上层培养基倾倒于PDA固体培养基，30℃下避光培养2～3 h，选择红色较深的菌株保存。

1.2.4.2二级筛选

将初筛得到的菌株进行耐酒精性能的测定。配制不同酒精度10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol的麦芽汁培养基，将初筛得到的菌株分别接种于不同酒精度的麦芽汁培养基中，采用杜氏导管法，观察0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h小导管中的产气情况，选择产气快且量大的菌株。

1.2.4.3三级筛选

对正向突变的菌株进行遗传稳定性实验、糖类发酵实验、致死温度测定、耐高糖度测定、产酯能力测定等，筛选得到综合性能较高的酵母菌株。

（1）遗传稳定性实验：将二级筛选得到的正向突变酵母菌株进行传代培养，测定第2代、第5代、第8代、第11代酵母菌对酒精的耐受性，筛选遗传稳定性较好的突变酵母菌株。

（2）糖类发酵实验：将遗传稳定性较好的正向突变酵母菌株进行糖类发酵实验，将筛选得到的酵母菌分别接种在仅含有1种糖的培养基中，即葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、木糖、淀粉发酵培养基，采用杜氏试管法测定酵母菌株对不同糖的发酵利用情况。

（3）致死温度测定：将遗传稳定性较好的正向突变酵母菌株进行致死温度测定，将筛选得到的酵母菌接种于YPD液体培养基中，分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃条件下水浴15 min，29.0℃±1.0℃恒温培养箱培养3 d，采用杜氏试管法观察酵母菌的致死温度。

（4）耐高糖度测定：将筛选得到的酵母菌接种于糖度为18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx、28°Bx、30°Bx、32°Bx、34°Bx、36°Bx的YPD液体培养基中进行发酵培养，采用杜氏试管法观察酵母菌对高糖度培养基的耐受性。

（5）发酵产物的测定

酒精含量的检测：参照GB/T 10345—2007密度瓶法。

残糖含量的检测：采用生物传感分析仪进行测定。

酯、醇、醛类物质的测定：采用气相色谱仪进行测定。

气相色谱检测条件及方法：面积内标法；内标为乙酸正丁酯；柱温105℃，进样口温度140℃，检测器温度140℃；色谱柱：填充柱；色谱柱载体：Chromosorb W （AW），固定液为20%DNP（邻苯二甲酸二壬酯）加7%吐温80；载气：高纯氮，纯度＞99.999%，柱前压0.14 MPa。

2　结果与分析

2.1出发菌株的生长曲线

根据所测OD值作酿酒酵母的生长曲线，见图2。

如图2所示，6～14 h时，出发酵母菌株S1正处于对数生长期，生长繁殖旺盛。对数生长期是基因复制和重组的重要阶段，在此阶段对酵母菌进行等离子体辐照，可以增加基因突变、稳定遗传的几率，因此选择菌龄6～14 h的酵母菌进行诱变。

2.2菌悬液的制备

图2　酿酒酵母菌生长曲线

用大气压等离子体对酿酒酵母进行诱变处理，处理结果见图3。

图3　等离子体处理前后酵母菌平板涂布结果

如图3所示，图中（a）为处理前的酵母菌平板涂布，（b）为处理后的酵母菌平板涂布。对比两张图可以看出经过等离子体辐照处理后，酵母菌有明显的致死情况。

2.2.1酵母菌菌龄对等离子体诱变效果的影响

对不同菌龄的酵母菌进行同一条件的诱变处理，结果见图4。

图4　酵母菌菌龄对等离子体诱变的影响

如图4所示，致死率随酵母菌龄的增加呈递减趋势，正突变率呈先增加后平稳的趋势。在6～12 h，酵母菌的致死率较高，可能是因为在此阶段酵母菌刚刚进入对数期，细胞结构还不是很完整，抵抗等离子辐照的能力较弱。在12～14 h，致死率降低，可能是因为酵母菌进一步生长发育，细胞结构逐渐完整，抵抗等离子体辐照的能力加强。在6～12 h，正突变率呈上升的趋势，12 h后趋于平稳，这可能由于随着酵母菌进入对数期其活力及自身修复机制增强，且在菌龄12 h后相应细胞自身修复机制已逐渐达到最佳状态，因此酵母菌正突变率不断提高并趋于稳定。综合致死率与正突变率曲线，将酵母菌龄定为12 h。

2.2.2酵母菌浓度对等离子体诱变效果的影响

对不同浓度的酵母菌进行同一条件的诱变处理，结果见图5。

图5　酵母菌浓度对等离子体诱变的影响

如图5所示，致死率随酵母菌浓度的增大呈递减趋势，正突变率呈先增加后减少的趋势。在104～106个/mL，酵母菌在此阶段基数较小，单个酵母菌受到等离子体的攻击作用较强，酵母菌损伤程度较高，导致致死率较高；在106～108个/mL，酵母菌基数较大，单个酵母菌受到等离子体的攻击作用较弱，致死率较低；在104～106个/mL，正突变率呈上升的趋势，在106个/mL达到最高点，在106～108个/mL，正突变率呈下降趋势。结合致死率与正突变率曲线，将酵母菌浓度定为106个/mL。

2.3酿酒酵母诱变条件的建立

2.3.1处理时间对酿酒酵母诱变效果的影响

对同一条件的酿酒酵母进行不同时间的处理，结果见图6。

图6　等离子体处理时间对酿酒酵母诱变的影响

如图6所示，随着处理时间的增加致死率先上升后下降再上升，是马鞍型曲线。正突变率先不变，后呈先上升后下降趋势。等离子体辐照对酵母菌会造成损伤，当损伤积累到一定程度时酵母菌机体能启动自身的修复机制，这与产生的马鞍形曲线相吻合，并与吴玉峰等［12］的研究结果具有一致性。正突变率最高的点一般出现在致死率曲线的极小值处（即修复机制被激发的点）［12］，如图6，正突变率在14 min达到最大值17.24%。结合致死率与正突变率曲线，初步确定最佳处理时间为14 min。

2.3.2电压对酿酒酵母诱变效果的影响

用不同电压处理同一条件酿酒酵母菌，结果见图7。

图7　等离子体辐照电压对酿酒酵母诱变的影响

如图7所示，随辐照电压的增大，致死率先上升后下降再上升，是马鞍型曲线。正突变率先增大后减小。正突变率最高点和致死率曲线极小值处电压为165 V，结合致死率与正突变率曲线，初步确定最佳辐照电压为165 V。

2.3.3电极与样品间距对酿酒酵母诱变效果的影响

用不同电极与样品间距处理同一条件酿酒酵母菌，结果见图8。

图8　等离子电极与样品间距对酿酒酵母诱变的影响

如图8所示，随着电极与样品间距的减小，致死率先上升后下降再上升，是马鞍型曲线。正突变率先增大后减小。正突变率最高的点和致死率曲线的极小值处电极与样品间距为4.0 cm，结合致死率与正突变率曲线，初步确定最佳电极与样品间距为4.0 cm。

2.3.4氩气流速对酿酒酵母诱变效果的影响

用不同氩气气流处理同一条件酿酒酵母菌，结果见图9。

如图9所示，随着氩气流速的增大致死率先上升后下降再上升，是马鞍型曲线。正突变率先增大后减小。正突变率最高的点和致死率曲线的极小值处氩气流速为1.0 L/h。结合致死率与正突变率曲线，初步确定最佳氩气流速为1.0 L/h。

图9　不同等离子氩气流速对酿酒酵母诱变的影响

2.4酿酒酵母诱变条件的正交实验

如表1所示，比较K值大小得出，致死率最高的组合为A3B3C1D3，即辐照时间为16 min，辐照电压为170 V，辐照距离为3.8 cm，氩气流速为1.2 L/h。又因为RC＞RA＞RD＞RB，所以辐照距离对等离子诱变酵母菌的致死率影响最显著，其次是辐照时间、氩气流速，辐照电压对等离子体诱变酵母菌的致死率影响最小。

如表1所示，比较K'值大小得出，根据正突变率最高的组合为A2B2C2D2，即辐照时间为14 min，辐照电压为165 V，辐照距离为4.0 cm，氩气流速为1.0 L/h，此条件下正突变率最高。又因为R'A＞R'B＞R'C＞R'D，所以辐照时间对正突变率影响最显著，其次是辐照电压、辐照距离，氩气流速对等离子体诱变酵母菌的正突变率影响最小。

2.5突变酵母菌的筛选

2.5.1一级筛选

图10　TTC显色反应图

根据图10可以看出，通过等离子体诱变处理后，酵母菌发生了不同程度的变异，不同酵母菌株其代谢能力不同，颜色越深，其代谢越旺盛，从中挑选颜色较深、菌株较大的酵母菌进行保留，经一级筛选共筛选得到酵母菌429株。

2.5.2二级筛选

通过探究大气压等离子对酵母菌株诱变的最佳条件及在最佳条件下的初步筛选，共从429株菌种中筛选得到46株正向突变菌株。与出发菌株S1相比，这46株酵母菌对酒精的耐受性较高、起酵速度较快。

2.5.3三级筛选

将酵母菌进行传代培养，酵母菌对酒精的耐受性发生不同程度改变，部分酵母菌株对酒精耐受性的遗传稳定性较差，其中11株突变酵母菌株S45、S53、S132、S143、S182、S245、S302、S304、S353、S375、S377的遗传稳定性良好，对酒精的耐受性≥17%。

这11株酵母菌对糖类的利用与出发菌株一致，可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖进行发酵产生CO2，不能利用乳糖、木糖、淀粉进行发酵，其余各项指标检测结果见表2。

其中S45、S53、S182、S377等4株酵母菌的产酒精能力较强，较出发菌株S1其产酒精能力分别提高了27.51%、28.91%、25.14%、26.53%，S1、S45、S53、S182的发酵产物色谱图结果见图11—图14。

表1　正交实验结果

表2　酵母菌株致死温度

表3　酵母菌发酵产物含量表

图11　酵母菌S1发酵产物色谱图

图12　酵母菌S45发酵产物色谱图

酵母菌经过等离子体处理后，发酵产物的种类和数量都发生了明显变化，酯类、醇类、醛类等都有不同程度的改变，结果见表3。

图13　酵母菌S53发酵产物色谱图

图14　酵母菌S182发酵产物色谱图

如表3所示，突变菌株S45、S53、S182这3株菌株产酯能力较强。S45、S53、S182乙酸乙酯产量分别是S1的 1.95倍、2.68倍、11.15倍；菌株S45较出发菌株S1产生新的酯类，即乙酸异戊酯；菌株S53、S182较出发菌株S1产生新的酯类，即乳酸乙酯。

突变菌株S45产杂醇类含量较少。菌株S45的甲醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇产量分别降低为出发菌株S1的93.75%、67.61%、86.73%、60.87%、47.63%。

突变菌株S45、S53产醛类含量较少。S45、S53发酵液乙醛含量分别为出发菌株S1的77.53%、73.14%。

3　结果与讨论

以酿酒酵母菌对酒精的耐受性为指标，得到酿酒酵母大气压等离子体诱变的最佳条件为：酵母菌菌龄为12 h、酵母菌浓度为106个/mL、辐照电压为165 V、辐照时间为14 min、样品与等离子电极间距为4 cm和氩气流速为1.0 L/h。

从大气压等离子体诱变得到的429株酵母菌中，通过耐酒精实验、遗传稳定性实验等最终筛选得到11株酒精耐受性强、遗传稳定性好的酵母菌S45、S53、S132、S143、S182、S245、S302、S304、S353、S375、S377，对酒精的耐受性≥17%。其中，经综合筛选得到综合性能优良的耐酒精突变酵母菌株S45：对酒精的耐受性≥18%；发酵液酒精含量达18.24%，产酒精能力提高了27.51%；发酵液乙酸乙酯产量是S1的1.95倍，产量达到14.4 mg/L，并产生新的酯类，即乙酸异戊酯；产杂醇类含量较少，甲醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇的产量分别降低为出发菌株S1的93.75%、67.61%、86.73%、60.87%、47.63%；产醛类含量较少，乙醛产量为出发菌株S1的77.53%。

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Establishment of the Conditions of Atmospheric Plasma-Inducing Mutation of S.cerevisiae and Breeding of an Ethanol-Tolerant Strain

FANG Peipei，WANG Shiqing，LI Jing，XIONG Xubo，TAN Haigang and LIU Xiaoli
（College of Food Science and Engineering，QingdaoAgricultural University，Qingdao，Shandong 266100，China）

S.cerevisiae plays an important role in alcoholic fermentation process，however，it has the problems such as poor alcohol tolerance and slow fermenting rate.In this study，atmospheric plasma-inducing mutation was adopted，S.cerevisiae strain S1 was used as original strain，fatality rate and positive mutation rate was used as the evaluating indexes，and the influencing factors including the age of S.cerevisiae，the concentration of S.cerevisiae suspension，irradiation voltage，irradiation time，the distance from the electrode to samples，and argon airflow speed etc.were investigated.Afterwards，the mutant strains were screened out through TTC color reaction，alcohol resistance determination，genetic stability test，sugar fermentation test，fatal temperature determination，high glucose tolerance test and esters-producing capacity test.The optimal atmospheric plasma-inducing mutation conditions were determined as follows:the age of S.cerevisiae was 12 h，the concentration of S.cerevisiae suspension was 106/mL，irradiation voltage was 165 V，irradiation time was 14 min，the distance from the electrode to samples was 4 cm，and argon airflow speed was 1.0 L/h.Finally，a mutant strain S45 with strong ethanol tolerance was obtained.

atmospheric plasma；mutagenesis；Saccharomyces cerevisiae；breeding

TS261.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）09-0031-07

10.13746/j.njkj.2016163

国家自然科学基金资助项目（31271963）。

2016-05-13；

2016-06-14

方佩佩（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品安全贮藏。

王世清（1963-），男，教授，博士研究生，研究方向为食品安全保藏。

优先数字出版时间：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1059.004.html。