11种保健酒中游离氨基酸的比较分析

李沁娅，孙宝国，郑福平，黄明泉，孙金沅，孙啸涛，李贺贺

（1.北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京100048； 2.北京工商大学北京市食品风味化学重点实验室，北京100048； 3.北京工商大学食品质量与安全北京实验室，北京100048）

11种保健酒中游离氨基酸的比较分析

李沁娅，孙宝国，郑福平，黄明泉，孙金沅，孙啸涛，李贺贺

（1.北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京100048； 2.北京工商大学北京市食品风味化学重点实验室，北京100048； 3.北京工商大学食品质量与安全北京实验室，北京100048）

通过使用氨基酸自动分析仪，对国内市场上的11种保健酒中的游离氨基酸进行了定性定量分析，研究结果显示，11种保健酒中共检测到25种氨基酸，包含6种人体必需氨基酸，另外，天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、1-甲基组氨酸、乙醇胺、磷酸丝氨酸、鹅肌肽等是首次在保健酒中检出，并对其进行了定量分析；11种保健酒的总游离氨基酸质量浓度范围在32.17～1799.14 mg/L之间，其中，宁夏红枸杞酒（1799.14 mg/L）和沱牌枸杞酒（1183.98 mg/L）的总游离氨基酸含量明显多于其他保健酒；通过聚类分析，宁夏红枸杞酒、沱牌枸杞酒与其他酒样可以明显区分开来。

氨基酸自动分析； 保健酒； 游离氨基酸； 定量分析； 聚类分析

中国的保健酒，是指对人体具有保健功能的饮料酒，同时具备有3种属性，即食品属性、功能属性和非药品属性［1］。不同保健酒的原料差别很大，其制作方法可分为浸提法、酿制法、配制法［2］。保健酒具有活血化瘀、抗炎症、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等保健功能，截止2014年6月，获得国家审批注册的保健酒已有529种［3］，并还在持续增加。

目前，国内针对保健酒的研究，集中在利用各种食品和药材，如富硒酵母蛋白［4］、多肽液［5］、食用菇［6］、乌毛蕨［7］、杜仲［8］、玛咖［9］等所具有的保健功能，开发新的保健酒，通过优化其工艺，并对保健功能和营养成分的相关指标进行研究［10］，如抗氧化能力、多酚、黄酮、总糖、氨基酸、原料中特有功效成分等。如李昱鼎［11］利用竹子、茶和糯米，采用黄酒的工艺发酵制竹茶酒，优化其发酵工艺，并研究了竹茶酒在体外、体内的抗氧化活性；郑向华［12］综述了黑米酒中氨基酸、生物活性肽、碳水化合物、维生素、矿物质、黄酮类物质等营养和保健成分的研究，并介绍了几种新型的黑米保健酒及其营养保健功效。氨基酸含量不仅是保健食品的重要营养指标之一［13］，还与酒中的一些挥发性物质的来源有一定关系［14］，也会影响酒精饮料的风味［15］。早在1986年詹炳耀［16］发现，杜康酒中所测出的氨基酸含量都达不到相应的味觉阈值，但补加勾兑品尝试验表明，氨基酸对口味有明显影响。我国国内对保健酒中氨基酸的研究资料较少，多是对所配制研发的某种酒样进行分析［17］，对商品保健酒中的氨基酸分析的文献较少［18］，且所分析的氨基酸种类在18种内。

氨基酸自动分析仪基于高效阳离子交换树脂柱分离及柱后茚三酮衍生法对氨基酸进行自动检测，具有操作简单、自动化高、重复性好等优点［19］。氨基酸分析仪通常分为蛋白质水解系统（钠盐系统）和生理体液系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱；钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，可以更全面的反映氨基酸的信息［20］。本研究通过使用氨基酸自动分析仪，首次采用生理体液系统较全面地分析了市售11种保健酒中游离氨基酸的类别及含量。本研究可为保健酒的营养评价和保健功效提供基础参考数据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

酒样：均购自当地超市及网上专卖店，并于4℃下保存。酒样相关信息见表1。

试剂：5-磺基水杨酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；39种生理体液氨基酸混合标准品：磷酸丝氨酸（Phser）、牛磺酸（Taur）、磷酸乙醇胺（Pea）、尿素（Urea）、天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、肌氨酸（Sarc）、α-氨基己二酸（AAAA）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Citr）、α-氨基丁酸（Aaba）、颉氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、胱硫醚（Cysth）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、β-丙氨酸（B-ala）、苯丙氨酸（Phe）、β-氨基异丁酸（Baiba）、高半胱氨酸（Homocys）、γ-氨基丁酸（Gaba）、乙醇胺（Ehan）、羟赖氨酸（Hylys）、鸟氨酸（Orn）、赖氨酸（Lys）、1-甲基组氨酸（1-Mhis）、组氨酸（His）、3-甲基组氨酸（3-Mhis）、鹅肌肽（Ans）、肌肽（Car）、精氨酸（Arg），美国SIGMA公司。

仪器设备：高速冷冻离心机（TGL-16gR），上海安亭科学仪器厂；氮气吹干仪（BF-2000），北京八方世纪科技有限公司；Biochrom30+全自动氨基酸分析仪，英国Biochrom公司；移液枪（100～1000µL），北京吉尔森科技有限公司；漩涡振荡混匀器（Vortex Mixers-SA8），英国Stuart公司。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的配制及定量方法

所购买的标准品中磷酸丝氨酸、牛磺酸、磷酸乙醇胺、尿素、乙醇胺、鹅肌肽、肌肽等不属于氨基酸的物质，方便起见，本文统一记为氨基酸。由于色氨酸容易分解，标准品混合液中不含色氨酸。

混合标准品中胱氨酸摩尔浓度为0.125 mmol/L，其他氨基酸摩尔浓度均为0.250 mmol/L。将混合标准品分别稀释成13个不同梯度的标准液，其稀释倍数为2倍、2.5倍、4倍、6倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍、200倍、500倍。

将13个不同梯度氨基酸标准溶液同样条件下进样，每个浓度重复3次，建立标准曲线。然后进行样品测试，样品中检测出的氨基酸通过保留时间进行定性，最后根据样品中所测氨基酸含量区间，选择合适的标准品浓度绘制摩尔浓度-峰面积标准曲线，采用外标法进行定量。

1.2.2样品前处理方法

摇匀酒样，取3 mL保健酒样品，加入3 mL 10%的5-磺基水杨酸，摇匀后于4℃冰箱中静置22 h取出，以10000 r/min离心15 min后取1 mL上清液于进样瓶，40℃氮吹干后加入1 mL的pH2.2缓冲液，漩涡振荡混匀，过0.22µm滤膜，上机检测。每个酒样2瓶，各取样2次进行实验。

1.2.3检测条件

色谱柱：Biochrom Li型阳离子交换树脂柱，4.6 mm× 20 cm；柱温：31～75℃；缓冲液流速：20 mL/h；茚三酮流速：20 mL/h；检测波长570 nm、440 nm；分析时间125 min，进样量80µL。

1.2.4数据分析

对11种市售保健酒中所测氨基酸含量用SPSS 20.0采用Ward法-平方Euclidean距离进行系统聚类分析，并绘出树状图，见图3。

表1　保健酒样品信息

图1　39种氨基酸标准品的分离图谱

2　结果与分析

2.139种游离氨基酸分离图谱及线性回归方程建立

39种生理体液氨基酸标准品的分离图谱见图1，样品分离见图2。除羟脯氨酸和脯氨酸在440 nm波长下检测外，其余37种氨基酸均在570 nm波长下检测。

图2　劲酒样品的分离图谱

由图1和图2可知，氨基酸分离效果较好，基线干扰少。通过与标准品的保留时间进行比对，11种保健酒共定性出25种氨基酸，其余14种氨基酸有的没有检测到，有的被杂峰影响无法定性定量。所测到的25种游离氨基酸的线性回归方程见表2。由表2可知，除乙醇胺的线性系数为0.9867外，其余氨基酸的线性系数在0.9918～0.9996之间，方程线性关系良好。

2.2定量结果分析

保健酒酒样中25种游离氨基酸的定量结果见表3，表中氨基酸含量用平均值±标准偏差表示，其中磷酸丝氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇胺、鸟氨酸、1-甲基组氨酸、鹅肌肽这10种氨基酸是首次对其在保健酒中的含量进行定量。

由表3可知，11种不同保健酒中总游离氨基酸的含量差别较大，总游离氨基酸质量浓度范围在32.17～1799.14 mg/L；酒样H（宁夏红枸杞酒，1799.14 mg/L）和酒样B（沱牌枸杞酒，1183.98 mg/L）的总游离氨基酸含量最高，酒样A（中国劲酒）以463.09 mg/L的含量排名第3，其他酒样所测得氨基酸含量均小于200 mg/L；酒样I（茵陈酒，32.17 mg/L）、酒样D（阳春牌酒，40.17 mg/L）和酒样K（五加皮酒，55.09 mg/L）中含量较少。在所测酒样中，酒样A（中国劲酒）中检测到特有成分鹅肌肽（6.88 mg/L），酒样B（沱牌枸杞酒）中检测到特有成分胱氨酸（2.94 mg/L），酒样E（人参酒）中检测到特有成分瓜氨酸（1.70 mg/L），酒样F（至宝特质三鞭酒）中检测到特有成分天冬酰胺（9.47 mg/L）。

表2　保健酒样中所含游离氨基酸的线性回归方程

表3　保健酒样中游离氨基酸的定量结果

在所测出的25种氨基酸中，有6种人体必需氨基酸，即缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸，11种保健酒中人体必需氨基酸的总量占总氨基酸的比例不同，在4.67%～19.18%之间；所测酒样中所含游离必需氨基酸的质量浓度范围在5.74～95.73 mg/L，酒样B（沱牌枸杞酒，95.73 mg/L）中含量最多，其次是酒样H（宁夏红枸杞酒，83.98 mg/L）、酒样A（中国劲酒，28.38 mg/L）、酒样C（椰岛海王酒，13.06 mg/L），酒样D（阳春牌酒，5.74 mg/L）中含量最少。

通过对各酒样中所测出的游离氨基酸含量从大到小排列，将累计总和达到80%的氨基酸定义为主要氨基酸，见表4。从表3和表4可以看出，精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸在酒样A、B、D、G、H、K中为含量较高的5种游离氨基酸，酒样E中最主要的游离氨基酸为精氨酸。通过比较本实验结果与张庄英［21］等所测大量白酒样品中游离氨基酸含量可知，整体看来保健酒中的游离氨基酸含量比白酒多，其原因与保健酒中所用原料相关，即保健酒原料中的氨基酸会溶解在酒中。

表4　各保健酒样中主要的游离氨基酸

根据所测每种保健酒中各氨基酸的含量，对11种保健酒进行聚类分析，结果见图3。从树形图可以看出，11种保健酒分为2大类：第1类为酒样B（沱牌枸杞酒）和酒样H（宁夏红枸杞酒），这两种枸杞酒与其他保健酒有比较明显的差别；第2类分的层次较多，酒样A（中国劲酒）与酒样C、D、E、F、G、I、J、K可以区分开，酒样E又可与酒样C、D、F、G、I、J、K再次区分，可能是由于酒样E中精氨酸的比例明显大于其他酒样。酒样C、D、G、I、J、K聚为一类，虽然氨基酸含量有差异，但聚类没有将其明显区分开来。聚类结果产生的原因可能与各种保健酒的原料及生产工艺有很大关系。

图3　11种保健酒中氨基酸的聚类分析图

综上所述，保健酒中较高含量的游离氨基酸，不仅包括人体必需的氨基酸，还含有一些功能性氨基酸，这些氨基酸对人体都有重要的生理保健功能。必需氨基酸有甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等，甲硫氨酸参与胆碱的合成，具有去脂、防治动脉硬化高血脂症的功能，可以提高肌肉活力并促进合成皮肤蛋白质和胰岛素；苯丙氨酸在机体内可以转变为酪氨酸，促进合成甲状腺素和肾上腺素；亮氨酸可以促进伤口及骨头愈合，缺乏亮氨酸会导致机体停止生长，体重减轻［22］。除必需氨基酸外，其他氨基酸也会影响人体的氮平衡及相关生理功能，如γ-氨基丁酸是功能性氨基酸，是一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有降血压、改善脑功能、增强记忆、抗焦虑及提高肝肾机能等生理作用［23-24］；甘氨酸、脯氨酸参与胶原形成及细胞外基质重构，有助于伤口愈合［25］；精氨酸有抗氧化、调节激素分泌和基因表达、增强免疫力的作用［26］，并与精子的数量和活动力有关；丝氨酸参与合成半胱氨酸、嘌呤、嘧啶、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸及蛋白质磷酸化［25］。

3　结论

通过使用氨基酸自动分析仪，对11种保健酒中所含游离氨基酸做了定性定量分析，检测出25种游离氨基酸，其中天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、1-甲基组氨酸、乙醇胺、磷酸丝氨酸、鹅肌肽等是首次在保健酒中检出。11种保健酒测得的总游离氨基酸质量浓度范围在32.17～1799.14 mg/L，不同保健酒中氨基酸含量差别较大。通过聚类分析，发现沱牌枸杞酒和宁夏红枸杞酒与其他酒可以明显区分开来，可能与这2种保健酒枸杞原料比例较大、氨基酸含量较高有关。

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Comparative Analysis of Free Amino Acids in 11 Kinds of Healthcare Wine

LI Qinya，SUN Baoguo，ZHENG Fuping，HUANG Mingquan，SUN Jinyuan，SUN Xiaotao and LI Hehe
（1.BeijingAdvanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048；2.Beijing Key Lab of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048；3.Beijing Lab for Food Quality and Safety，Beijing 100048，China）

In this study，free amino acids in 11 kinds of healthcare wine in domestic market were determined quantitatively and qualitatively by using automatic amino acid analyzer.The results suggested that，25 kinds of amino acids in total were detected in 11 kinds of healthcare wine including 6 necessary amino acids；In addition，asparagine，citrulline，cystathionine，β-alanine，γ-aminobutyric acid，ornithine，1-methyl histidine，ethanolamine，phosphoserine and anserine were detected and quantified for the first time in healthcare wine；total free amino acid concentration in 11 kinds of healthcare wine ranged between 32.17 mg/L and 1799.14 mg/L，among them，total free amino acid contents in Ningxiahong wolfberry wine（1799.14 mg/L）and in Tuopai wolfberry wine（1183.98 mg/L）were significantly higher than other healthcare wine. Through cluster analysis，it was found that Tuopai wolfberry wine and Ningxiahong wolfberry wine could be clearly distinguished from other healthcare wine products.

automatic amino acid analysis；healthcare wine；free amino acid；quantification；cluster analysis

TS262.91；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0038-05

10.13746/j.njkj.2016147

国家自然科学基金项目（31471665和31301466）；北京市教委科技计划重点项目（KZ20140011015）。

2016-04-28

李沁娅（1992-），女，在读硕士研究生，研究方向为分析检测，E-mail：liqinya1634051@163.com。

黄明泉（1977-），男，副教授，主要从事食品风味研究，E-mail：hmqsir@163.com。

优先数字出版时间：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1345.009.html。