基于Kriging代理模型对产不饱和脂肪酸的酒曲微生物混菌比例优化

刘　昕，吴天祥，赵群丽，朱俊杰，吴彩云

（1.贵州大学酿酒与食品工学院，贵州贵阳550025； 2.贵州省轻工业科学研究所，贵州贵阳550007）

基于Kriging代理模型对产不饱和脂肪酸的酒曲微生物混菌比例优化

刘昕1，2，吴天祥1，赵群丽1，朱俊杰1，吴彩云1

（1.贵州大学酿酒与食品工学院，贵州贵阳550025； 2.贵州省轻工业科学研究所，贵州贵阳550007）

Kriging代理模型常常作为工程计算领域的一种优化方法，通过选取动态点能有效提高Kriging代理模型的精确度，这种方法在优化多目标问题上具有高精度的特点，本实验设置了酒曲微生物混菌10组不同比例（V细∶V酵∶V霉=1∶0∶0、0∶0∶1、0∶1∶0、1∶1∶1、4∶4∶2、4∶2∶4、2∶4∶4、2∶2∶6、2∶6∶2、6∶2∶2）进行实验，混合液态发酵7 d后，以5种不同的不饱和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸）甲酯化后的含量为基础点进行Kriging方法模型建立。通过优化模型的建立选取了3组混合比例（V细∶V酵∶V霉=1.6∶2.7∶5.7、1.7∶3.9∶4.4、1.9∶1.9∶6.2）进行验证实验，当预测值的含量与验证实验真实值的相对偏差小于10%时，说明此方法可行。通过验证实验，选取V细∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2作为最终的优化结果。

Kriging模型； 混合菌株； 液态发酵； 不饱和脂肪酸； 比例优化

在中国白酒酿造过程中，微生物的参与及各方面的贡献作用不可忽视。霉菌主要作为糖化功能菌，酵母主要参与产酒与生香，细菌在酿造过程中与大部分风味物质的形成相联系。所以白酒酿造过程中主要的三大类微生物彼此协同，也可能在某些阶段相互抑制［1-9］。这些酒曲微生物在发酵和酿造的过程中除了形成主要的风味物质，也会形成一些微量成分，这些微量成分除对酒体风味香气有贡献外，还对人体起到保健作用，其中一类微量成分——不饱和脂肪酸就是对人体有益的，它能防止心血管疾病、免疫调节、保护视网膜等［10-17］。

代理模型方法，又称近似模型方法，是一种解决复杂工程优化设计问题的方法。它的主要思路是利用样本点拟合出的代数模型代替真实模型，从而减少求解真实模型所需花费的时间。Kriging模型由于适用于拟合高度非线性、多峰值的问题而得到了更广泛的应用［18-20］。然而在利用Kriging代理模型［21-24］寻优的过程中，通过初始样本所建立的代理模型往往无法得到全局最优，因为初始样本并不能完全覆盖整个设计空间；因此，在优化设计的过程中，往往采用代理模型的动态更新，将一些新的采样点加入模型样本集；通过不断改善模型的全局或者局部精度，来逐渐逼近一个收敛的优化结果。

本研究通过气相分析细菌、酵母、霉菌3种混合菌株液态发酵7 d后产的5种不饱和脂肪酸（肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸），将其甲酯化后的含量为Kriging代理模型的基点，采用Kriging代理模型来进行建模。通过建立的模型得到预测的实验结果，最后通过验证实验找到最终优化的混菌比例。采用新的优化方法Kriging代理模型应用在生物类的统计分析中，为除响应面优化法以外的另一种优化思路提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

实验菌种：细菌DX-2，酵母菌XJ-4，霉菌XM-4（细菌从董酒大曲中分离筛选得到；酵母菌、霉菌分别从董酒小曲中分离筛选得到）。

试剂：正己烷、乙醇均为色谱级，无水乙醇、甲醇、浓硫酸等化学试剂均为分析纯（见表1）。

表1　实验不饱和脂肪酸甲酯标准品

1.2仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器（LS-B75L-I），江阴宾江医疗设备有限公司；台式空气恒温摇床（TS-2102C），上海天呈实验仪器制造有限公司；气相色谱仪（Agilent 7890），美国Agilent。

1.3实验方法

1.3.1摇瓶发酵培养

在装有90 mL液体发酵培养基和10 mL浸提液（大、小酒曲浸提液分别添加设置为不同的实验组）的250 mL三角瓶中，空白组则不添加浸提液装100 mL的液体发酵培养基。分别将各种种子液以5%的接种量接入到液体发酵培养基中，分别贴上标签。置于恒温30℃、180 r/min条件培养10 d。每天取发酵液测定其不饱和脂肪酸含量。

1.3.2发酵液甲酯化处理

取发酵液10 mL于25 mL具塞试管中，再加入甲醇2 mL，浓硫酸2滴，60℃水浴酯化30 min。冷却后转入30 mL分液漏斗中，依次加入5 mL正己烷、2 mL饱和NaCl，振荡1 min，静置分层后收集有机相于25 mL容量瓶中，水相连续用正己烷萃取2次，分别收集有机相于容量瓶中，定容后用于气相色谱（GC）进样分析。

1.3.3气相色谱条件

KB-FFAP毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；Agilent 7890气相色谱仪柱箱程序升温条件35℃（5 min）→7℃/min→100℃（2 min）→10℃/min→220℃（4 min），载气（N2）流速：0.4 mL/min；H2流速40 mL/min；Air流速400 mL/min；尾吹：30 mL/min；分流比：35∶1；进样口温度：240℃；FID检测器温度：260℃；进样量1.0 μL。

1.3.4Kriging代理模型的建立

Kriging模型假设系统的响应值与自变量间的真实关系可表示成以下形式：

式中：y（x）为未知Kriging模型；f（x）为已知的关于x的函数，其为类似于响应面法的多项式模型，提供了设计空间内的全局近似模型；z（x）为一随机过程，是在全局模型的基础上创建的均值为0但方差不为0的局部偏差。z（x）的协方差可表示为：

式中：R是相关矩阵；R（xi，xj）表示任意2个样本点xi和xj的相关函数，目前已经出现了多种相关函数，如指数函数、高斯函数、样条函数等。本文选取高斯函数作为相关函数，其表达式为：

预测近似模型可写为：

式中：Ys为样本点响应量矩阵；f为全1列向量；R为样本点相关矩阵。即：

r（x）为样本点和预测点之间的相关向量：

（4）式中的未知常数β可由广义最小二乘法得到：

方差由下式求得：

（3）式中的相关参数θ可通过极大似然估计得到：

表2　大曲浸提液组发酵7 d时各不饱和脂肪酸甲酯的含量

任意一个θ值都能生成一个插值模型，最终的Kriging模型是通过利用优化方法找出最优的θ值，使得似然函数最大，从而使得构造模型精度最高。

预测值y^（x）的精度取决于样本点与预测点x之间的距离，样本点离x越近，预测值y^（x）的误差也就越小，通常用均方根误差（RMSE）来表示。

1.4统计方法

所有的实验组均做3个平行，得到的实验数据取用平均值±标准偏差。用Excel 2010处理数据和Tecplot作图。

2　结果与分析

设置了7组混菌实验组及3组纯种实验组进行液态发酵，共10组实验组分别为V细∶V酵∶V霉=1∶0∶0、0∶0∶1、0 ∶1∶0、1∶1∶1、4∶4∶2、4∶2∶4、2∶4∶4、2∶2∶6、2∶6∶2、6∶2∶2进行气相（GC）分析并以分析的5种不饱和脂肪酸的含量为基础分别进行Kriging代理模型数学方法建模优化。通过纯种液态发酵得到在发酵周期为7 d时，各不饱和脂肪酸甲酯的含量，见表2。

从表2可看出，各实验组之间5种不饱和脂肪含量差异不大，其中，每组的5种不饱和脂肪酸中棕榈油酸、油酸、亚油酸含量相对比其余的2种高。α-亚麻酸是各实验组中最微量的。以表1中各不饱和脂肪酸甲酯化的含量为基础，用1.3.4的数学方法及Matlab编程进行建模，用Modefrontier在建模的基础上进行优化。

尽管不同的种子液比例不仅影响产出多种甲酯的最大含量，同时也决定了含量出现最大时的时间节点，但由于含量与时间节点均是关于3种种子液含量的函数，为了简化分析模型，忽略时间周期与最大含量之间的关系。另外为了获得最优的种子液比例，可采用穷举法的思路大量尝试各种比例，最终选出含量最高的比例，但该方法存在效率低、成本高的缺点，因此，本文采用了基于Kriging代理模型的方法，利用有限样本构建种子液比例与含量之间的函数关系，该方法已在其他领域获得巨大的成功，Kriging代理模型具备精度高、所需样本少、计算速度快等特点。通过10次试验的结果作为模型样本，分别建立了肉豆蔲油酸甲酯、棕榈油酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、α-亚麻酸甲酯含量与酵母菌、细菌、霉菌种子液的函数模型（如图1—图5所示），其中x坐标是酵母菌种子液含量、y坐标是细菌种子液含量、Z轴是相应物质的含量，3种种子液接种的总体积均为10 mL，该方法能使数学模型由四维模型降阶到三维模型，便于图像展示。

图1　大曲浸提液组肉豆蔻油酸甲酯预测模型

图2　大曲浸提液组棕榈油酸甲酯预测模型

由图1—图5可以看出，当酵母菌∶细菌∶霉菌种子液含量比约为3.2∶2.7∶4.1时，肉豆蔲油酸甲酯含量到达峰值；酵母菌∶细菌∶霉菌种子液含量比约为3.5∶2.7∶3.8时，棕榈油酸甲酯含量到达峰值；酵母菌∶细菌∶霉菌种子液含量比约为3.2∶3∶3.8时，油酸甲酯含量到达峰值；酵母菌优化，符合现代人们追求身体保健的观点［25-28］，并且从另一方面说明中国白酒中的微量成分对人们身体有重要作用。将优化目标确定为α-亚麻酸甲酯的含量与其他4种物质含量之和，由于其他4种物质含量的数量级不同，采用简单的累加会使得其中某一项物质主导了优化结果，因此对4种物质之和进行了归一化后累加的方式，利用多目标遗传算法对2个目标进行了优化，图6是优化结果。∶细菌∶霉菌种子液含量比约为10∶0∶0时，亚油酸甲酯含量到达峰值；酵母菌∶细菌∶霉菌种子液含量比约为2∶2∶6时，α-亚麻酸甲酯含量到达峰值。

图3　大曲浸提液组油酸甲酯预测模型

图4　大曲浸提液组亚油酸甲酯预测模型

图5　大曲浸提液组α-亚麻酸甲酯预测模型

由于种子液比例与所产生物质之间的函数关系相似度非常差，在很多时候存在着此消彼长的现象，因此如何选择最优比例需要建立物质最优含量的评价函数，多个文献表明，α-亚麻酸的食物来源比较少，并且其在微量的情况下对人体有好处，因此以α-亚麻酸作为主要指标

图6　大曲浸提液组优化结果

由优化结果可以看出，α-亚麻酸甲酯的含量与其他4种物质含量之和的目标存在明显的矛盾，α-亚麻酸甲酯的含量提升意味着其他4种物质之和含量的降低，因此选出了3组具有代表性的优化预测结果，见表3。

以上述3组优化预测结果中的细菌、酵母菌、霉菌3种种子液的体积比为依据，进行验证实验。实验的方法过程均与优化之前的相同。经过7 d的发酵周期，取发酵液进行GC分析，测定5种不饱和脂肪酸含量，与预测结果中的含量相比较，结果见表4。

根据Kriging模型优化的理论，只要真实值与预测值之间的误差小于10%，证明该方法可行，预测结果可信。从表4可看出，V细∶V酵∶V霉=1.6∶2.7∶5.7时，油酸甲酯与α-亚麻酸甲酯的真实值与预测值之间的误差大于10%，而另外2个组中的5种不饱和脂肪酸的真实值与预测值之间的误差均小于10%。当V细∶V酵∶V霉=1.9∶1.9 ∶6.2时，α-亚麻酸甲酯的含量比V细∶V酵∶V霉=1.7∶3.9∶4.4中的含量较高。综合考虑，最终选择V细∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2为优化的结果。

3　结论

通过采用新型的Kriging代理模型优化方法对酒曲微生物混菌比例进行优化，通过建立的模型优化找到几组预测精度高的混菌比例结果，将得到的预测比例进行验证实验，最终选取得到混菌比例中的各不饱和脂肪酸含量与预测值中的含量进行相对误差偏差计算，误差低于10%，便说明此方法成立，优化可行。最后通过验证实验得到V细∶V酵∶V霉=1.9∶1.9∶6.2，为大曲浸提液实验组的最终优化结果。总之，本实验利用建立Kriging模型方法来优化生物类问题，是比较创新的一种思路和方法。此方法相对响应面优化来说可以实现多目标优化，提高了优化效率，在精准度方面也比其更精准仔细。另外，把工程方面的计算方法应用在农学、生物学等学科有时也是可行的，同时也促进了学科知识系统领域间的相互借鉴和融合。

表3　大曲浸提液组优化预测结果

表4　大曲浸提液组验证实验结果

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Optimization of Mixed Ratio of Microbial Strains to Produce Unsaturated Fatty Acids Based on Kriging Model

LIU Xin1，2，WU Tianxiang1，ZHAO Qunli1，ZHU Junjie1and WU Caiyun1
（1.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025；2.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550007，China）

Kriging model，as a commonly-used optimization method in engineering calculation field，its accuracy could be improved effectively by selecting dynamic points.This method is featured by high precision in the optimization of multiple targets.In the experiment，ten groups of microbial strains of different mixed ratio（Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1∶0∶0，0∶0∶1，0∶1∶0，1∶1∶1，4∶4∶2，4∶2∶4，2∶4∶4，2∶2∶6，2∶6:∶2，6∶2∶2）were set up，7 d after mixed liquid fermentation，the Kriging models had been established with the content of five kinds of unsaturated fatty acids after esterification（fourteenolefinic acid methyl，palm methyl oleate，methyl oleate，linoleic acid methyl ester，alpha linolenic acid）as the basic points.The optimized Kriging models were then verified in three groups（mixed ratio of Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1.6∶2.7∶5.7，1.7∶3.9∶4.4，1.9∶1.9∶6.2）.As the deviation of predicted values and real values was less than 10%，the model was feasible.In conclusion，the mixed ratio Vbacteria∶Vyeast∶Vmold=1.9∶1.9∶6.2 was the best choice in practice.

Kriging model；mixed microbial strains；liquid-state fermentation；unsaturated fatty acids；ratio optimization

TS262.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）09-0023-05

10.13746/j.njkj.2016192

董香型白酒工艺创新技术合作项目。

2016-05-31

刘昕（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：6123755@qq.com。

吴天祥（1965-），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为发酵工程，E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn。

优先数字出版时间：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1038.008.html。