MicroRNA-595在炎症性肠病中的表达及其意义

康　颖　路又可　王震凯　袁柏思　施　慧　汪芳裕

南京军区南京总医院消化内科(210002)



MicroRNA-595在炎症性肠病中的表达及其意义

康颖路又可王震凯袁柏思施慧汪芳裕*

南京军区南京总医院消化内科(210002)

背景：MicroRNAs调控异常与肠黏膜屏障损伤、肠道炎症以及肠道功能紊乱的发生有关。炎症性肠病(IBD)患者存在microRNAs表达异常。目的：探讨microRNA-595(miR-595)在IBD中的表达及其意义。方法：纳入2012年7月—2014年7月南京军区南京总医院收治的IBD患者100例，其中溃疡性结肠炎(UC) 63例，克罗恩病(CD) 37例，根据疾病活动性分为活动期UC(aUC)组、缓解期UC(rUC)组、活动期CD(aCD)组、缓解期CD(rCD)组，选取42例同时期健康体检者作为正常对照(NC)组。采集入选者的血清和肠黏膜组织标本，采用荧光定量PCR检测血清和肠黏膜组织miR-595表达水平。将分别含神经细胞黏附分子1(NCAM1)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)3’ UTR序列的荧光素酶报告基因质粒与miR-595质粒共转染人结肠癌细胞株HCT116，检测miR-595对NCAM1、FGFR2转录活性的影响。结果：UC组和CD组血清和肠黏膜组织miR-595表达水平较NC组显著升高(P<0.05)，aUC组、aCD组分别显著高于rUC组、rCD组(P<0.05)。MiR-595可结合NCAM1、FGFR2的3’ UTR序列以抑制两者的转录活性。结论：MiR-595在IBD患者血清和肠黏膜组织中表达升高并与疾病活动性相关，其通过抑制紧密连接蛋白NCAM1和FGFR2表达，导致肠黏膜屏障受损，促进肠道炎症发生。MiR-595可作为诊断IBD及其活动性评估的血清生物学标记物。

结肠炎，溃疡性；Crohn病；微RNAs；神经细胞黏附分子1；成纤维细胞生长因子受体2

Fibroblast Growth Factor Receptor 2

炎症性肠病(IBD)是一组肠道慢性非特异性炎性疾病，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。目前IBD的病因尚未明确，可能与遗传易感人群在肠道持续感染、肠黏膜屏障缺陷以及环境改变等多因素作用下发生肠道免疫功能紊乱有关。肠黏膜屏障功能缺陷是IBD的发病机制之一，其可导致细菌、毒性物质等通过黏膜屏障进入机体，促进肠道炎症发生[1-2]。

MicroRNAs是一类具有调控功能的内源性非编码RNA，长约20～25个核苷酸。microRNAs在多种免疫相关疾病中表达异常，近年研究认为其与IBD发病有密切联系[3-4]。McKenna等[5]的研究显示，microRNAs在肠上皮细胞分化和维持肠黏膜屏障功能中发挥重要作用。本研究通过检测microRNA-595(miR-595)在IBD患者血清和肠黏膜中的表达，旨在明确miR-595在IBD中的作用。

材料与方法

一、研究对象

纳入2012年7月—2014年7月南京军区南京总医院收治的IBD患者100例，其中UC 63例，CD 37例，诊断标准参考《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[6]。入组患者根据疾病活动性分为活动期UC(aUC)组、缓解期UC(rUC)组、活动期CD(aCD)组、缓解期CD(rCD)组，UC疾病活动性评估采用改良Mayo评分系统，CD疾病活动性评估采用简化CD活动指数(CDAI)[6]。排除患有其他自身免疫性疾病(如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎等)、感染性疾病(如急性肠炎、肠结核、肠阿米巴痢疾等)以及肿瘤性疾病的患者。选取42例同时期健康体检者作为正常对照(NC)组。本研究方案经南京军区南京总医院伦理委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。

二、方法

1. 细胞株、主要试剂和PCR引物：人结肠癌细胞株HCT116购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，培养于含1%青-链霉素双抗+10%胎牛血清的DMEM培养基中(37 ℃，5% CO2)。MiRcute miRNA提取试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒、miR-595和内参照U6引物购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeScriptTM逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，荧光素酶报告基因质粒pGL3、Lipofectamine®2000转染试剂、miR-595质粒、miR-595质粒突变体购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，Dual-Luciferase®报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

2. 标本采集：采集入选者结肠镜活检肠黏膜组织标本。结肠镜检查前1 d抽取外周血5 mL待测。

3. 荧光定量PCR：参照miRcute miRNA提取试剂盒说明书提取血清、肠黏膜组织总RNA，采用琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA完整性和纯度，采用紫外分光光度计检测RNA浓度。参照PrimeScriptTM逆转录试剂盒和miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书采用两步法逆转录合成cDNA，反应条件均为37 ℃ 60 min。参照miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒说明书行PCR扩增，取1 μL cDNA加入10 μL反应体系进行扩增，反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共42个循环。MiR-595引物上游：5’-GXG AAG TGT GCC GTG GT-3’，下游：5’-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3’；U6引物上游：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。以2-ΔΔCt法分析目的miRNA相对表达量。

4. 荧光素酶报告基因检测：根据生物信息学数据库miRecords和miRWalk预测miR-595的结合靶点，发现神经细胞黏附分子1(neural cell adhesion molecule 1， NCAM1)、成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2， FGFR2)可能为其直接作用靶点。构建含NCAM1、FGFR2 3’UTR序列的荧光素酶报告基因质粒，NCAM1引物上游：5’-TCT GCT GCG GTA GAA AGT GG-3’，下游：5’-CGG CAT GGG CTA AAT TTC CG-3’；FGFR2引物上游：5’-GGG AAT ATA CGT GCT TGG CG-3’，下游：5’-CGT GGT CTT CAT TCG GCA AAA-3’。采用Lipofectamine®2000转染试剂将pGL3-NCAM1质粒、pGL3-FGFR2质粒分别与miR-595质粒共转染HCT116细胞，以含目的基因的pGL3质粒与miR-595突变体质粒共转染作为对照组。采用Dual-Luciferase®报告基因检测试剂盒检测目的基因NCAM1、FGFR2的荧光素酶活性。

三、统计学分析

结　　果

一、一般情况

UC组患者63例，其中男36例，女27例，年龄21～74岁，平均(41.6±10.4)岁；CD组患者37例，其中男20例，女17例，年龄16～69岁，平均(38.3±9.2)岁；NC组42例，其中男25例，女17例，年龄19～69岁，平均(40.5±12.4)岁；三组间性别构成、年龄差异无统计学意义。aUC组患者30例，其中男19例，女11例，年龄21～69岁，平均(41.3±9.4)岁；rUC组患者33例，其中男17例，女16例，年龄21～74岁，平均(42.3±11.2)岁；两组间性别构成、年龄差异无统计学意义。aCD组患者20例，其中男11例，女9例，年龄16～67岁，平均(36.3±7.1)岁；rCD组患者17例，其中男9例，女8例，年龄19～69岁，平均(39.4±8.4)岁；两组间性别构成、年龄差异无统计学意义。

二、血清miR-595表达情况

荧光定量PCR检测显示，UC组血清miR-595表达水平较NC组升高(2.00±0.32)倍(P=0.021)，CD组较NC组升高(2.20±0.45)倍(P=0.014)(图1A)。进一步分析显示，aUC组血清miR-595表达水平较rUC组升高(1.68±0.31)倍(P=0.043)，aCD组较rCD组升高(1.92±0.41)倍(P=0.032)(图1B、1C)。

三、肠黏膜组织miR-595表达情况

荧光定量PCR检测显示，UC组肠黏膜组织miR-595表达水平较NC组升高(1.40±0.21)倍(P=0.032)，CD组较NC组升高(1.50±0.12)倍(P=0.023)(图2A)。进一步分析显示，aUC组肠黏膜组织miR-595表达水平较rUC组升高(1.30±0.17)倍(P=0.027)，aCD组较rCD组升高(1.53±0.29)倍(P=0.032)(图2B、2C)。

四、MiR-595对NCAM1、FGFR2转录活性的调控

荧光素酶报告基因检测显示，pGL3-NCAM1质粒、pGL3-FGFR2质粒分别与miR-595质粒共转染HCT116细胞后，荧光素酶活性分别较pGL3-NCAM1质粒、pGL3-FGFR2质粒与miR-595突变体质粒共转染细胞显著降低(P<0.05)，提示miR-595可结合NCAM1、FGFR2的3’ UTR序列，对两者转录活性具有抑制作用(图3)。

讨　　论

MicroRNAs是非编码小分子RNA， 可调控转录后基因表达。MiR-595属于microRNAs家族成员， 但其功能目前尚未明确，近期研究[7-9]显示其与骨髓增生异常综合征的发病有关，并参与成神经细胞瘤细胞自噬以及成胶质细胞瘤细胞增殖。Veltman等[10]的研究表明，miR-595可抑制紧密连接蛋白pard6和ZO-2表达，使上皮细胞紧密连接受损，从而导致肠黏膜屏障功能损伤。进一步的研究发现，益生菌制剂可通过调控miR-595和紧密连接蛋白表达，修复损伤的肠黏膜屏障，提示miR-595表达升高可能在IBD的发病过程中发挥一定作用。本研究对miR-595在IBD中的表达及其意义进行了探讨，结果显示IBD患者血清和肠黏膜组织miR-595表达显著升高，且miR-595表达水平在活动期与缓解期IBD患者间存在显著差异，提示miR-595与IBD发病相关， 可作为诊断IBD的特异性标记物，并可用于评估IBD活动性。

图1　IBD患者和NC组血清miR-595表达情况

图2　IBD患者和NC组肠黏膜组织miR-595表达情况

图3　HCT116细胞NCAM1、FGFR2转录活性变化

NCAM1作为细胞黏附分子家族中的一员，属于免疫球蛋白超家族，多表达于神经细胞，亦可表达于肠道组织，发挥肿瘤抑制作用[11-13]。Shimamoto等[14]的研究表明，UC患者炎症黏膜内表达NCAM1(CD56)的自然杀伤细胞受体阳性T细胞明显减少，可能与肠道炎症的发生有关。FGF具有稳定肠黏膜屏障功能以及促进上皮修复的作用，相关机制包括促进肠黏膜上皮细胞增殖、迁移、血管再生以及调节细胞分化等[15-16]。诸多研究[17-19]表明，FGF及其受体表达减少与肠道炎症的发生密切相关。本研究通过质粒共转染和荧光素酶报告基因检测证实，NCAM1和FGFR2为miR-595的靶基因， miR-595可靶向结合NCAM1和FGFR2的3’ UTR序列以抑制两者的转录活性。IBD患者miR-595表达上升可能通过下调NCAM1和FGFR2表达，导致肠黏膜屏障受损，促进肠道炎症、溃疡等发生。

目前临床诊断IBD的血清学指标主要为C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)等炎性标记物，但这类标记物缺乏特异性，且不能反映肠道黏膜损伤情况。内镜以及组织病理学检查是诊断IBD的金标准，但检查为侵入性，且操作复杂。寻找一种简单、准确的IBD诊断方法成为目前亟待解决的问题。本研究结果显示IBD患者血清和肠黏膜组织miR-595表达升高，且其表达水平与IBD疾病活动性呈正相关，可作为诊断IBD及其活动性评估的特异性血清生物学标记物。相关机制可能为miR-595通过靶向结合紧密连接蛋白NCAM1和FGFR2而抑制两者表达，从而导致肠黏膜屏障受损，促进肠道炎症发生。随着对microRNAs在IBD发病机制中作用研究的不断深入，外周血microRNAs如miR-595可为IBD的诊治提供新的靶点。

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(2015-11-13收稿；2016-01-27修回)

Expression and Significance of MicroRNA-595 in Inflammatory Bowel Disease

KANG Ying, LU Youke, WANG Zhenkai, YUAN Bosi, SHI Hui, WANG Fangyu.

Department of Gastroenterology and Hepatology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Nanjing (210002)Correspondence to: WANG Fangyu, Email: cat409@126.com

Background: Dysregulation of microRNAs is associated with intestinal mucosal barrier injury, intestinal inflammation and intestinal dysfunction. Abnormal expression of microRNAs occurs in patients with inflammatory bowel disease (IBD). Aims: To investigate the expression and significance of microRNA-595 (miR-595) in IBD. Methods: A total of 100 patients with IBD at Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA from July 2012 to July 2014 were enrolled, in which 63 cases were ulcerative colitis (UC) and 37 cases were Crohn’s disease (CD). According to disease activity, patients were divided into active UC (aUC) group, remissive UC (rUC) group, active CD (aCD) group and remissive CD (rCD) group. A total of 42 healthy subjects were served as normal control (NC) group. Specimens of serum and intestinal tissue were collected. Expression of miR-595 in serum and intestinal tissue was determined by fluorescence quantitative PCR. Luciferase report gene plasmid containing the 3’ UTR of neural cell adhesion molecule 1 (NCAM1) or fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) and plasmid containing miR-595 were co-transfected into human colon cancer cell line HCT116 to detect the effect of miR-595 on transcriptional activities of NCAM1 and FGFR2. Results: Expression of miR-595 in serum and intestinal tissue in UC and CD groups was significantly higher than that in NC group (P<0.05), and that in aUC and aCD groups was significantly higher than that in rUC and rCD groups, respectively (P<0.05). MiR-595 could down-regulate the transcriptional activities of NCAM1 and FGFR2 through directly binding to the 3’ UTR of NCAM1 and FGFR2. Conclusions: Expression of miR-595 in serum and intestinal tissue is increased in patients with IBD and correlates with disease activity. MiR-595 inhibits the expressions of tight junction protein NCAM1 and FGFR2, thereby inducing injury of intestinal mucosal barrier and promoting intestinal inflammation. MiR-595 can serve as a serum biomarker for diagnosis of IBD and disease activity evaluation.

Colitis, Ulcerative;Crohn Disease;MicroRNAs;Neural Cell Adhesion Molecule 1;

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.005

*本文通信作者，Email: cat409@126.com