XAF1转录变异体在结直肠肿瘤中的差异表达*

周永柏　吴　伟　王继德　张亚历&

深圳市龙岗中心医院消化科1(518116)　南方医科大学南方医院消化内科2



·论著·

XAF1转录变异体在结直肠肿瘤中的差异表达*

周永柏1#吴伟1王继德2张亚历2&

深圳市龙岗中心医院消化科1(518116)南方医科大学南方医院消化内科2

背景：X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)能与XIAP结合而拮抗其caspase抑制活性，从而促进细胞凋亡，已被认定是一种肿瘤抑制基因。在多种肿瘤细胞中可检测到XAF1转录变异体，但不同转录变异体在结直肠肿瘤中的表达情况尚不明确。目的：检测XAF1及其转录变异体在不同结直肠组织中的表达，初步探讨其在结直肠肿瘤发生、发展中的作用。方法：收集结直肠癌及其配对癌旁组织、增生性息肉、腺瘤和正常结直肠黏膜组织样本，以免疫组化法和蛋白质印迹法检测XAF1蛋白表达，RT-PCR检测XAF1转录变异体表达。结果：与正常结直肠黏膜相比，XAF1蛋白在增生性息肉、腺瘤和癌组织中的胞核表达强度显著降低(P<0.05)，胞质表达强度有所增高(P>0.05)，总体表达强度显著降低(P<0.05)。结直肠癌组织中的XAF1A蛋白表达显著低于相应癌旁组织(P<0.05)。转录变异体XAF1A、XAF1B、XAF1C mRNA在结直肠肿瘤中的表达均显著低于正常结直肠黏膜(P<0.05)。结论：XAF1及其转录变异体在结直肠肿瘤和正常结直肠黏膜中存在差异表达，腺瘤阶段即已出现XAF1表达下降并由胞核向胞质易位。转录后修饰可能影响XAF1基因功能。

X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1；基因，肿瘤抑制；RNA加工，转录后；转录变异体；

结直肠肿瘤

Background: The tumor suppressor, X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-associated factor 1 (XAF1) is a XIAP-binding protein that antagonizes the anti-caspase activity of XIAP, thereby enhancing apoptosis. Transcriptional variants of XAF1 have been detected in various tumor cells, however, the expression profile of these transcriptional variants in colorectal neoplasms remains unclear. Aims: To investigate the expressions of XAF1 and its transcriptional variants in different colorectal tissues and their roles in tumorigenesis and development of colorectal neoplasms. Methods: Samples of colorectal cancer and paired adjacent tissue, hyperplastic polyp, adenomatous polyp, and normal colorectal mucosa were collected from surgical operation or endoscopic biopsies. XAF1 protein expression was detected by immunohistochemistry and Western blotting, and the transcriptional variants of XAF1 were detected by RT-PCR. Results: Compared with normal colorectal mucosa, the expression level of XAF1 protein in nucleus was significantly reduced (P<0.05) and that in cytoplasm was slightly increased (P>0.05) in hyperplastic polyp, adenomatous polyp, and cancerous tissue, and the overall expression level of XAF1 protein was decreased (P<0.05). XAF1A protein expression in cancerous tissue was significantly reduced when compared with the paired adjacent tissue (P<0.05). mRNA expressions of three transcriptional variants of XAF1, XAF1A, XAF1B and XAF1C were all significantly lower in neoplastic tissues than in normal mucosa (P<0.05). Conclusions: XAF1 and its transcriptional variants are differentially expressed in colorectal neoplasms and normal colorectal mucosa. These changes occurred initially in adenomatous polyp accompanied by a redistribution of XAF1 from nucleus to cytoplasm. Post-transcriptional modification may affect XAF1 gene function.

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发生率在恶性肿瘤中居第4位。随着分子生物学技术的发展，现已证实结直肠癌的发生是一个涉及多基因改变逐渐累积的多阶段复杂过程，一般认为其演变规律为“正常肠上皮→增生性改变/微小腺瘤→早期腺瘤→中期腺瘤→后期腺瘤→癌→癌转移”，但亦有研究表明部分结直肠癌直接起源于正常黏膜生发中心的干细胞而与腺瘤无关，即denovo癌。上述两种演变过程均伴有多种癌基因和抑癌基因的改变[1]。X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor 1, XAF1)为X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)相关因子，能与XIAP直接结合，通过拮抗其caspase抑制活性而起促进细胞凋亡的作用[2-3]。研究显示XAF1广泛表达于正常组织，但在多种肿瘤细胞中呈低表达或不表达，在调控细胞周期、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等方面发挥重要作用，已被认定是一种肿瘤抑制基因[4-7]。XAF1 mRNA有多种转录变异体，这些转录变异体分别编码不同蛋白，在肿瘤发生、发展中可能起不同甚至相反的作用[8-10]。最近Hatakeyama等[11]发现了一个新的XAF1转录变异体XAF1F，并发现XAF1C和XAF1F在含有循环肿瘤细胞的胃癌患者外周血中表达上调；本课题组前期研究[10]还发现，XAF1C在悬浮生长的转移性胃肠道肿瘤细胞株中呈高表达。目前国内尚未见关于XAF1转录变异体在结直肠肿瘤中表达情况的文献报道。本研究通过检测XAF1及其转录变异体在不同结直肠组织中的表达，初步探讨其在结直肠肿瘤发生、发展中的作用。

材料与方法

一、标本来源

结直肠组织标本来源为南方医科大学南方医院手术室和消化内镜中心。27例结直肠癌、51例结直肠腺瘤、24例增生性息肉和36例正常结直肠黏膜组织样本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm 厚连续切片，HE染色，行病理学检查、诊断和免疫组化染色；138例患者中男性83例，女性55例，年龄12～82岁，平均(48.2±15.2)岁。20例结直肠癌及其配对癌旁组织(距癌灶边缘5 cm)样本离体后10 min内迅速置于液氮中，转-80 ℃冰箱保存，用于蛋白质印迹法检测。42例结直肠癌及其配对癌旁组织、28例结直肠腺瘤和14例正常结直肠黏膜组织样本离体后10 min内迅速置于RNA样本保存液中，-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR。所有样本来源病例取材前均未接受过化疗或放疗，并排除其他恶性肿瘤。

二、主要试剂

兔抗人XAF1多克隆抗体(针对C端305～317氨基酸，Abcam plc.)，羊抗人XAF1A多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，超敏SP免疫组化试剂盒、DAB染色液(福州迈新生物技术开发有限公司)；RNA样本保存液、RNAiso Plus、Premix TaqTM(TAKARA BIO INC.)，RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.)。PCR引物由Invitrogen公司合成(表1)。

表1　PCR引物序列和产物长度

三、方法

1. 免疫组化染色(SP法)：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗3次，3% H2O2覆盖10 min灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗3×5 min；枸椽酸钠(pH 6.8)微波抗原修复10 min，PBS漂洗3×5 min；加入正常山羊血清孵育30 min封闭非特异性抗体；加入兔抗人XAF1抗体(1∶250)，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3×5 min；加入羊抗兔二抗，室温孵育15 min，PBS漂洗3×5 min；加入HRP标记链霉卵白素工作液，室温孵育10 min，PBS漂洗3×5 min；加入DAB染色液，显微镜下观察显色(3 min)，蒸馏水洗中止，苏木精复染，分化返蓝，脱水，封片。以正常兔IgG代替XAF1一抗作为阴性对照。

结果判定：于光学显微镜下放大400倍观察、评估XAF1胞核、胞质和总体染色情况。染色强度评分：0分，无染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。细胞显色率评分：每张切片随机选取4个视野，分别计数100个细胞，计算阳性细胞百分率。总分为两项评分之积：0分，阴性；0～0.5分，弱阳性；0.5～2分，中等阳性；>2分，强阳性。

2. 蛋白质印迹法：取结直肠组织100 mg，加入1 mL强效RIPA裂解液和1% PMSF冰上匀浆，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。50 μg/孔总蛋白上样，行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入羊抗人XAF1A抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜，TBS-T洗膜3×10 min；加入兔抗羊二抗(1∶4 000)，室温孵育2 h，TBS-T洗膜3×10 min，ECL法显影。UVP GDS7500型光密度扫描仪扫描成像，Image Pro Plus v6.0软件提取条带灰度值。癌组织中目的蛋白相对表达量以该蛋白条带灰度值与相应癌旁组织蛋白条带灰度值的比值表示。

3. RT-PCR：取结直肠组织100 mg，按试剂说明书操作提取总RNA，电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA浓度。取3 μg总RNA行逆转录反应，反应体系总体积20 μL，按试剂盒说明书进行操作。取2 μL逆转录产物行PCR反应，反应体系总体积25 μL，引物序列见表1。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环(内参β-actin 25个循环)；72 ℃ 8 min。PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳，UVP GDS7500型光密度扫描仪扫描成像，Image Pro Plus v6.0软件提取条带灰度值。目的基因mRNA相对表达量以其条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示。同时取2例健康成年男性外周血(3 mL)，提取淋巴细胞总RNA作为正常对照。

四、统计学分析

结　　果

一、XAF1蛋白在不同结直肠组织中的表达

免疫组化染色显示，XAF1表达于结直肠黏膜腺体细胞的胞核和胞质，间质细胞和肌细胞不表达。正常结直肠黏膜中，XAF1主要表达于黏膜腺体细胞核，越靠近黏膜表面表达越强，胞质不表达或低表达；增生性息肉中，XAF1主要表达于黏膜腺体细胞的胞核和胞质，胞质表达明显增多；腺瘤组织，特别是具有高度癌变潜能的管状绒毛状腺瘤中，XAF1以胞质表达为主，胞核不表达或低表达；癌组织中，胞核、胞质均有XAF1表达，个体间差异较大(图1)。与正常黏膜组织相比，XAF1在增生性息肉、腺瘤和癌组织中的胞核表达强度显著降低(P<0.05)，胞质表达强度有所增高， 但差异无统计学意义(P>0.05)，总体表达强度显著降低(P<0.05)。XAF1表达强度与样本来源个体的性别、年龄、样本取材部位、腺瘤分化程度(异型增生程度)均无相关性(表2)。

表2　XAF1蛋白表达与结直肠肿瘤临床病理特征的关系

A：阴性对照；B：正常结直肠黏膜；C：增生性息肉；D：腺瘤；E、F：结直肠癌

二、XAF1A蛋白在结直肠癌及其癌旁组织中的表达

蛋白质印迹法检测显示，与相应癌旁组织相比，结直肠癌组织中的XAF1A蛋白表达明显降低，相对表达量为0.83±0.34，差异有统计学意义(P=0.037)(图2)。

T：癌组织；N：癌旁组织；1 Da=0.992 1 u

三、XAF1 3个转录变异体在不同结直肠组织中的表达

RT-PCR检测显示，XAF1A mRNA在正常结直肠黏膜、腺瘤、癌组织及其癌旁组织中的相对表达量分别为0.84±0.31、0.64±0.25、0.63±0.36和0.82±0.46，腺瘤和癌组织明显低于正常黏膜组织，癌组织明显低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。由于XAF1B、XAF1C mRNA相对表达量数据不符合正态分布，故转换为定性资料进行分析，结果显示腺瘤和癌组织中XAF1B、XAF1C mRNA阳性表达率均显著低于正常黏膜组织(P<0.05)；癌组织中两者阳性表达率虽高于相应癌旁组织，但差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。检测还发现，XAF1B、XAF1C mRNA在正常结直肠黏膜中为低表达(电泳条带较暗)，在腺瘤和癌组织中或表达缺失，或表达较强(电泳条带较亮)(图3)。2例健康成年男性外周血淋巴细胞中可检测到XAF1A、XAF1B mRNA，但未检测到XAF1C mRNA。

表3XAF1 3个转录变异体在不同结直肠组织中的表达n(%)

组别例数XAF1AmRNAXAF1BmRNAXAF1CmRNA正常黏膜1414(100.0)13(92.9)12(85.7)腺瘤2828(100.0)20(71.4)*19(67.9)*癌组织4242(100.0)30(71.4)*24(57.1)*癌旁组织4242(100.0)28(66.7)22(52.4)

*与正常结直肠黏膜比较，P<0.05

T：癌组织；N：癌旁组织

图3XAF1 3个转录变异体在结直肠癌及其癌旁组织中的表达

讨　　论

细胞凋亡抑制可促进肿瘤进展、免疫逃逸及其对化疗、放疗的抵抗。近年来，越来越多的凋亡调控相关基因被发现和阐明。XAF1对凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins, IAPs)家族有普遍抑制作用，同时参与稳定p53蛋白，促进survivin蛋白降解，促进细胞色素C从线粒体释放，以及促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、紫外线等诱导的肿瘤细胞凋亡，在细胞凋亡中发挥重要作用，被认为是一种肿瘤抑制基因[4-7]，文献报道其在人类泌尿系、消化系肿瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤等中均呈低表达。结直肠癌的发生、发展是一个多阶段、涉及多基因改变逐渐累积的复杂过程，本研究通过检测XAF1及其转录变异体在结直肠癌及其癌前病变中的表达情况，旨在明确其在结直肠癌变过程中的作用。入组结直肠肿瘤样本来源病例均未合并其他恶性肿瘤；因目前尚无文献报道慢性疾病如糖尿病、高血压病、痛风等与XAF1转录变异体之间的相关性，故本研究未将是否合并慢性疾病纳入统计分析。

本研究结果显示，与正常结直肠黏膜相比，XAF1在增生性息肉、腺瘤和癌组织中的总体和胞核表达强度显著降低，胞质表达强度略有增高；在正常黏膜组织中，XAF1主要表达于腺体细胞核，且多为强阳性表达，胞质中虽亦有表达，但多为弱阳性表达；而在腺瘤组织，特别是具有高度癌变潜能的管状绒毛状腺瘤中，XAF1主要表达于细胞质，胞核多不表达或仅有弱阳性表达。上述发现与Ng等[12]对黑色素瘤的研究结果类似。同时，本研究还观察到，正常黏膜组织中靠近黏膜表面的腺体细胞核强表达XAF1，靠近肌层的腺体细胞或不表达，或主要表达于细胞质。结直肠黏膜为一不断更新的组织，黏膜表面的腺体细胞为老化细胞，即将发生凋亡。由此推测参与细胞凋亡的是表达于胞核的XAF1。肿瘤细胞中XAF1不表达或表达于胞质而不入核，可能是肿瘤细胞得以永生的原因之一。腺瘤组织中XAF1胞核表达强度降低、胞质表达强度增高，提示在结直肠癌变过程中，XAF1基因表达在腺瘤阶段即开始降低，并出现亚细胞定位改变。

由于本研究免疫组化染色使用的XAF1抗体为多克隆抗体，不能区分由XAF1不同转录变异体翻译的蛋白，故进一步以蛋白质印迹法检测了XAF1A在结直肠癌及其癌旁组织中的表达情况。结果显示癌组织中XAF1A蛋白表达显著低于相应癌旁组织，与免疫组化染色结果相符，证实XAF1在结直肠癌中呈低表达。

XAF1基因包括8个外显子，其mRNA经软件预测有24种转录变异体，其中19种可编码完整蛋白，目前在人类细胞或组织中检测到的有6种，即XAF1A-F[8-11]。XAF1A即通常所说的XAF1，含7个锌指结构，编码蛋白C端6个锌指结构与促凋亡作用有关，N端锌指结构(ZF-TRAF)则参与蛋白间的相互作用[2]。与XAF1A相比，XAF1B缺失外显子3(57 nt)，编码蛋白缺失19个氨基酸；XAF1C在外显子4和5之间多一个4b外显子(152 nt)，导致开放阅读框(ORF)出现中止密码子而只能编码含164个氨基酸的蛋白，其C端结构(由外显子4b编码的24个 氨基酸)不同于XAF1A，N端锌指结构则与XAF1A相同。XAF1D和XAF1E分别编码含141和122个氨基酸的蛋白，XAF1F与XAF1C一样ORF内含中止密码子。研究[13]发现在黑色素瘤细胞株A375中，单独表达外源性ZF-TRAF能剂量依赖性地抑制干扰素诱导的内源性XAF1的促凋亡作用，而表达ZF-TRAF缺失的外源性XAF1对干扰素诱导的细胞凋亡无影响。Fang等[9]的研究显示，前列腺癌细胞株LNCaP和DU145仅表达由XAF1B编码的截短XAF1蛋白，与XIAP间的相互作用受到影响，导致细胞凋亡平衡机制被打破，而抑制DNA甲基化可使XAF1B转变为全长XAF1A。上述发现提示XAF1不同转录变异体的编码蛋白可能因所含结构域不同而在细胞中起不同甚至是相反的作用。Chung等[14]以体外构建的XAF1表达载体转染结肠癌细胞株HCT116，则发现XAF1 5个转录变异体的编码蛋白均起促凋亡作用。Yin等[8]的研究显示，XAF1A与XAF1C mRNA的比值在不同类型肿瘤细胞株中存在差异。鉴于XAF1C N端ZF-TRAF结构与XAF1A相同而不含XAF1A的C端结构，推测其可能在肿瘤组织中起拮抗XAF1A的作用，肿瘤组织中两者比值不同可能在肿瘤发生、发展中起重要作用。XAF1C能否拮抗XAF1A的活性及其自身生物学活性有待进一步研究。

本研究中XAF1A mRNA在正常结直肠黏膜、腺瘤和癌组织中的相对表达量依次降低，癌组织显著低于相应癌旁组织，与Ma等[15]的研究结果相似。XAF1B、XAF1C mRNA阳性表达率在癌组织中略高于癌旁组织，但差异无统计学意义，在腺瘤和癌组织中均显著低于正常黏膜组织。本研究还发现XAF1B、XAF1C mRNA在正常黏膜组织中为低表达，在腺瘤和癌组织中或表达缺失，或表达较强；健康成年男性外周血淋巴细胞中有XAF1A、XAF1B mRNA表达，但不表达XAF1C mRNA。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)能选择性降解含有翻译提前终止密码子(premature translation termination codon, PTC)的mRNA，从而防止对机体有害的截短蛋白产生。既往文献报道含有PTC的XAF1C、XAF1F mRNA因NMD缺陷而在高度转移性胃癌细胞和含循环肿瘤细胞的胃癌患者外周血中聚集[11]，因此推测部分结直肠肿瘤组织中XAF1C表达增强可能与NMD缺陷有关。由于获取含循环肿瘤细胞的结直肠癌患者外周血样本较为困难，本研究未对此进行检测。

综上所述，本研究发现XAF1及其转录变异体在结直肠肿瘤和正常结直肠黏膜中存在差异表达，腺瘤阶段即已出现XAF1表达下降并由胞核向胞质易位，表明XAF1在腺瘤发生及其向腺癌演变过程中起抑癌基因作用。XAF1转录变异体XAF1B、XAF1C在结直肠腺瘤和癌组织中表达紊乱，两者在部分肿瘤组织中表达增强是否有抑制XAF1入核、影响其肿瘤抑制基因功能的作用，尚有待进一步研究。

1 林三仁. 消化内科学高级教程[M]. 北京: 人民军医出版社, 2013: 317-326.

2 Liston P, Fong WG, Kelly NL, et al. Identification of XAF1 as an antagonist of XIAP anti-Caspase activity[J]. Nat Cell Biol, 2001, 3 (2): 128-133.

3 Fong WG, Liston P, Rajcan-Separovic E, et al. Expression and genetic analysis of XIAP-associated factor 1 (XAF1) in cancer cell lines[J]. Genomics, 2000, 70 (1): 113-122.

4 Zhu LM, Shi DM, Dai Q, et al. Tumor suppressor XAF1 induces apoptosis, inhibits angiogenesis and inhibits tumor growth in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2014, 5 (14): 5403-5415.

5 Yang WT, Chen DL, Zhang FQ, et al. Experimental study on inhibition effects of the XAF1 gene against lung cancer cell proliferation[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15 (18): 7825-7829.

6 Sun PH, Zhu LM, Qiao MM, et al. The XAF1 tumor suppressor induces autophagic cell death via upregulation of Beclin-1 and inhibition of Akt pathway[J]. Cancer Lett, 2011, 310 (2): 170-180.

7 Zhao WJ, Deng BY, Wang XM, et al. XIAP associated factor 1 (XAF1) represses expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and regulates invasion, cell cycle, apoptosis, and cisplatin sensitivity of ovarian carcinoma cells[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015, 16 (6): 2453-2458.

8 Yin W, Cheepala S, Clifford JL. Identification of a novel splice variant of X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor 1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 339 (4): 1148-1154.

9 Fang X, Liu Z, Fan Y, et al. Switch to full-length of XAF1 mRNA expression in prostate cancer cells by the DNA methylation inhibitor[J]. Int J Cancer, 2006, 118 (10): 2485-2489.

10周永柏，张亚历，王继德，等. XAF1转录变异体在胃肠道肿瘤细胞株中的表达及意义[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2015, 24 (11): 1380-1383.

11Hatakeyama K, Yamakawa Y, Fukuda Y, et al. A novel splice variant of XIAP-associated factor 1 (XAF1) is expressed in peripheral blood containing gastric cancer-derived circulating tumor cells[J]. Gastric Cancer, 2015, 18 (4): 751-761.

12Ng KC, Campos EI, Martinka M, et al. XAF1 expression is significantly reduced in human melanoma[J]. J Invest Dermatol, 2004, 123 (6): 1127-1134.

13Leaman DW, Chawla-Sarkar M, Vyas K, et al. Identification of X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor-1 as an interferon-stimulated gene that augments TRAIL Apo2L-induced apoptosis[J]. J Biol Chem, 2002, 277 (32): 28504-28511.

14Chung SK, Lee MG, Ryu BK, et al. Frequent alteration of XAF1 in human colorectal cancers: implication for tumor cell resistance to apoptotic stresses[J]. Gastroenterology, 2007, 132 (7): 2459-2477.

15Ma TL, Ni PH, Zhong J, et al. Low expression of XIAP-associated factor 1 in human colorectal cancers[J]. Chin J Dig Dis, 2005, 6 (1): 10-14.

(2016-03-07收稿；2016-05-09修回)

Differential Expression of Transcriptional Variants of XAF1 in Colorectal Neoplasms

ZHOU Yongbai1, WU Wei1, WANG Jide2, ZHANG Yali2.1

Department of Gastroenterology, Longgang District Central Hospital of Shenzhen, Shenzhen, Guangdong Province (518116);2Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou Correspondence to: ZHANG Yali, Email: zyl41531@163.com

X-Linked Inhibitor of Apoptosis-Associated Factor 1;Genes, Tumor Suppressor;RNA Processing, Post-Transcriptional;Transcriptional Variants;Colorectal Neoplasms

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.003

深圳市龙岗区科技创新局项目(YS2013123)

#Email: bai0504@163.com

&本文通信作者，Email: zyl41531@163.com