MicroRNA-21通过PTEN/Akt通路介导前列腺素E2促进胃癌细胞的增殖*

周　皓　张绍仁　刘红燕

复旦大学附属金山医院消化内科(201508)



MicroRNA-21通过PTEN/Akt通路介导前列腺素E2促进胃癌细胞的增殖*

周皓张绍仁刘红燕#

复旦大学附属金山医院消化内科(201508)

背景：已有研究证实前列腺素E2(PGE2)可促进肿瘤细胞的增殖，microRNA-21(miR-21)可抑制肿瘤细胞增殖，但信号通路尚不明确。目的：探讨miR-21介导PGE2促进胃癌细胞增殖的潜在作用机制。方法：体外培养胃癌AGS细胞，分为对照组、PGE2组、anti-miR-21组、PGE2+anti-miR-21组，以WST-1比色法检测细胞生存率，流式细胞术检测细胞凋亡率，RT-PCR法检测miR-21 mRNA表达。以Akt特异性抑制剂哌立福辛干预AGS细胞，检测其对细胞增殖的影响，蛋白质印迹法检测PTEN/Akt蛋白表达。结果：与对照组相比，PGE2组AGS细胞生存率显著升高(P<0.05)，凋亡率显著降低(P<0.05)，miR-21 mRNA表达显著升高(P<0.05)。与PGE2组相比，anti-miR-21组、PGE2+anti-miR-21组细胞生存率显著降低(P<0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)，miR-21 mRNA表达显著降低(P<0.05)。以哌立福辛干预后，AGS细胞生存率显著降低(P<0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)，PTEN蛋白表达明显上调，p-Akt蛋白表达明显下调。结论：miR-21通过PTEN/Akt通路介导了PGE2促进胃癌细胞增殖的作用，可能成为防治胃癌的新靶点。

微RNAs；胃肿瘤；前列腺素E类；PTEN/Akt通路

Background: Prostaglandin E2(PGE2) could promote the proliferation of tumor cells, microRNA-21 (miR-21) could inhibit the proliferation of tumor cells, but its signal pathway is still unclear. Aims: To investigate the mechanism of PGE2on promoting proliferation of gastric cancer cells potentially mediated by miR-21. Methods: Gastric cancer AGS cells were cultured and divided into control group, PGE2group, anti-miR-21 group and PGE2+anti-miR-21 group. Cell proliferation was determined by WST-1 chromatometry. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry. The expression of miR-21 mRNA was detected by RT-PCR. After AGS cells were intervened by Akt specific inhibitor perifosine, cell proliferation was assessed, and expression of PTEN/Akt protein was detected by Western blotting. Results: Compared with control group, survival rate of AGS cells was significantly increased (P<0.05), apoptosis rate was significantly decreased (P<0.05), and expression of miR-21 mRNA was significantly increased in PGE2group (P<0.05). Compared with PGE2group, survival rate of AGS cells was significantly decreased (P<0.05), apoptosis rate was significantly increased (P<0.05), and expression of miR-21 mRNA was significantly decreased in anti-miR-21 group and PGE2+anti-miR-21 group (P<0.05). After intervention with perifosine, survival rate of AGS cells was significantly decreased (P<0.05), apoptosis rate was significantly increased (P<0.05), expression of PTEN protein was significantly increased, and expression of p-Akt protein was significantly decreased. Conclusions: MiR-21 mediates the promoting of proliferation of gastric cancer cells by PGE2through PTEN/Akt pathway, which might become a new target for the prevention and treatment of gastric cancer.

胃癌是目前严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其特点是病情进展快、预后差、五年生存率较低[1-2]。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)通过调节细胞增殖和凋亡[3]、促进肿瘤侵袭和血管形成以及逃避免疫监视等途径在肿瘤发生、发展的各个阶段发挥重要作用。MicroRNA(miR)是一类长度为17～25个核苷酸的非编码小分子RNA，在生物体的发育、增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用[4]。目前发现miR-21几乎在所有肿瘤中均高表达，通过抑制多种与肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭相关的抑癌基因而发挥作用[5-6]。有研究证实miR-21是肿瘤发生的关键癌基因[7]。本研究通过探讨miR-21在胃癌细胞生长增殖中的作用及其可能机制，旨在为miR-21的基础研究和胃癌的分子生物学治疗提供理论依据。

材料与方法

一、研究资料

人胃腺癌细胞株AGS购自美国ATCC细胞库(ATCC®CRL-1739TM)。人细胞因子PGE2、RPMI1640培养液、胎牛血清均购自上海宁盛生物科技有限公司。Anti-miR-21寡核苷酸序列由美国ABI公司设计并合成。PTEN/Akt单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。p-Akt单克隆抗体、Akt特异性抑制剂哌立福辛均购自Cell Signaling Technology公司。PCR引物miR-21、U6特异性探针引物由ABI公司合成，其余引物由Invitrogen公司合成。TaqMan MicroRNA检测试剂盒购自ABI公司。蛋白marker购自江苏凯基生物技术股份有限公司。WST-1购自碧云天生物技术公司。

二、研究方法

1. 细胞培养：AGS细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育。以0.25%胰酶消化，按1∶3的细胞比例传代，每三天传代一次。

2. 接种细胞：取对数生长期的AGS细胞，制成单细胞悬液，以每孔2×105个的密度接种于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。

3. 实验分组：①将AGS细胞分为对照组(不作任何处理)、PGE2(5 μmol/L)组、anti-miR-21组、PGE2(5 μmol/L)+anti-miR-21组，用于研究PGE2和anti-miR-21干预对AGS细胞增殖的影响；②将AGS细胞分为对照组(不作任何处理)、PGE2组、PGE2+哌立福辛(10 μmol/L)组、PGE2+anti-miR-21组、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛(10 μmol/L)组，用于研究哌立福辛对AGS细胞增殖的作用。

4. WST-1比色法检测细胞生存率：将1 mL电子耦合试剂加入WST-1粉末中，完全溶解，配制成WST-1溶液，4 ℃避光保存。每孔96孔板中加入10 μL WST-1溶液，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育2 h。96孔板置于摇床摇动1 min。以空白孔调零，酶联免疫检测仪检测450 nm波长处的每孔吸光度(A)值，细胞生存率(%)=处理孔A值/对照孔A值×100%。同一处理组设置6个平行孔，实验重复3次，取均值。

5. 流式细胞仪检测AGS细胞凋亡：收集各组AGS细胞，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次，取均值。

6. RT-PCR法检测miR-21表达：Trizol抽提RNA，逆转录合成cDNA，PCR反应：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，共40个循环；4 ℃ 10 min。Pri-miR-21引物：正向：5’-TTT TGT TTT GCT TGG GAG GA-3’，反向：5’-AGC AGA CAG TCA GGC AGG AT-3’。以RNU6B作为内参，正向：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TG-3’。以miR-21表达量与内参的比值作为miR-21相对表达量。

7. 蛋白质印迹法检测PTEN/Akt蛋白表达：哌立福辛干预48 h后，抽提各组细胞总蛋白，BCA法行蛋白定量。以β-actin作为内参照，每孔加入样品蛋白30 μg，行SDS-PAGE电泳，经PVDF膜转移，封闭2 h。一抗分别加入β-actin多克隆抗体(工作浓度1∶1 000)、PTEN(工作浓度1∶2 000)、Akt(工作浓度1∶1 000)、p-Akt抗体(工作浓度1∶1 000)，4 ℃冰箱孵育或摇床过夜。二抗加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记抗体(工作浓度1∶10 000)，孵育2 h。X线曝光、显影、定影，扫描后进行图像处理与分析。

三、统计学分析

结　　果

一、细胞生存率

PGE2和anti-miR-21干预48 h后，与对照组相比，PGE2组AGS细胞生存率显著升高(P<0.05)，anti-miR-21组、PGE2+anti-miR-21组显著降低(P<0.05)。与PGE2组相比，anti-miR-21组和PGE2+anti-miR-21组AGS细胞生存率显著降低(P<0.05)(表1)。

表1　PGE2和anti-miR-21干预对胃癌细胞增殖的影响

△与对照组比较，P<0.05；#与PGE2组比较，P<0.05

二、细胞凋亡率

与对照组相比，PGE2组AGS细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，anti-miR-21组和PGE2+anti-miR-21组显著升高(P<0.05)。与PGE2组相比，anti-miR-21组和PGE2+anti-miR-21组AGS细胞凋亡率显著升高(P<0.05)(图1)。

三、miR-21 mRNA表达

与对照组相比，PGE2组miR-21 mRNA表达显著升高(P<0.05)，anti-miR-21组和PGE2+anti-miR-21组显著下降(P<0.05)。与PGE2组相比，anti-miR-21组和PGE2+anti-miR-21组miR-21 mRNA表达显著下降(P<0.05)(图2)。

*与对照组比较，P<0.05；#与PGE2组比较，P<0.05

四、PTEN/Akt通路与AGS细胞生长的关系

与对照组相比，PGE2组PTEN蛋白表达明显下调，p-Akt蛋白表达明显上调；与PGE2组相比，PGE2+anti-miR-21组、PGE2+哌立福辛组、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组PTEN蛋白表达明显上调，PGE2+anti-miR-21组p-Akt蛋白表达明显下调，而PGE2+哌立福辛组、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组未能检测出p-Akt蛋白表达(图3)。

与对照组相比，PGE2组AGS细胞生存率显著升高(P<0.05)，PGE2+anti-miR-21组、PGE2+哌立福辛组、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组显著降低(P<0.05)。与PGE2组相比，PGE2+anti-miR-21组、PGE2+哌立福辛组、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组AGS细胞生存率均显著下降(P<0.05)。PGE2+anti-miR-21组AGS细胞生存率与PGE2+哌立福辛组相比无明显差异(P>0.05)(表2)。

图3　各组AGS细胞PTEN/Akt蛋白表达(蛋白质印迹法)

组别A值(x±s)生存率(%)对照组1.102±0.034100PGE2组1.423±0.018*129.13PGE2+anti-miR-21组0.748±0.037*#77.49PGE2+哌立福辛组0.876±0.018*#82.56PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组0.685±0.041*#57.06

*与对照组比较，P<0.05；#与PGE2组比较，P<0.05

五、哌立福辛干预后细胞凋亡情况

与对照组相比，PGE2组AGS细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，PGE2+anti-miR-21组、PGE2+哌立福辛组、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组显著升高(P<0.05)。与PGE2组相比，PGE2+anti-miR-21组、PGE2+哌立福辛组和PGE2+anti-miR-21+哌立福辛组AGS细胞凋亡率显著升高(P<0.05)(图4)。

图1　各组AGS细胞凋亡结果(流式细胞术)

图4　哌立福辛干预48 h后各组AGS细胞凋亡情况(流式细胞术)

讨　　论

胃癌的发病机制复杂， 其病理生理过程涉及多种细胞与细胞因子之间的相互作用。来源于花生四烯酸的脂质介质是肿瘤发生、发展过程中的信号分子，可通过环氧合酶(cyclooxygenase, COX)转化为各种PG而发挥相关的生物学功能，其同工酶主要为COX-1和COX-2[8]。已有研究证实COX-2为早期瞬时表达基因，在生理情况下不表达，而在炎症和肿瘤组织中的表达显著上调[9]。研究[10-11]表明COX-2在各种癌前病变和肿瘤中的表达显著增高，并与患者的预后呈负相关。COX-2的作用主要是通过其代谢产物PGE2来实现的，后者通过调节细胞增殖和凋亡、增加肿瘤侵袭和血管形成以及减少免疫监视功能而与肿瘤发生、发展的各个阶段密切相关。

计春燕等[12]的研究证实COX-2/PGE2通路在胃癌发生、发展中起有重要作用。本研究结果发现PGE2作用于AGS细胞48 h后，生存率为151.9%，细胞凋亡率仅为0.5%；anti-miR-21干预后细胞生存率为51.9%，细胞凋亡率高达47.2%；PGE2+anti-miR-21联合干预后细胞生存率为75.2%，细胞凋亡率为8.2%；PGE2组、anti-miR-21组、PGE2+anti-miR-21组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，且PGE2+anti-miR-21组与PGE2组相比差异亦有统计学意义(P<0.05)。证实PGE2能促进AGS细胞增殖，而anti-miR-21可减弱PGE2对AGS细胞增殖的刺激作用，miR-21可能介导了PGE2对AGS细胞增殖的刺激作用。

miR由70～90个核苷酸组成的发夹状单链RNA前体经Dicer酶加工而成，可调节mRNA表达或翻译，在生物体的发育、增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要生理作用[13]。Song等[14]的研究发现胃癌患者血清miR-21水平与肿瘤大小相关。Ishiguro等[15]指出，胃癌和非胃癌患者的胃组织中存在miR-21高表达。Zhang等[16]的研究发现，胃癌组织中miR-21表达显著高于癌旁组织，且与肿瘤分化、局部侵袭以及淋巴结转移密切相关。本研究结果显示PGE2组miR-21 mRNA表达较对照组显著升高(P<0.05)，PGE2+anti-miR-21组miR-21 mRNA表达较PGE2组显著下降(P<0.05)，提示miR-21可能参与了PGE2介导的促AGS细胞增殖作用。

为进一步了解miR-21介导的PGE2刺激AGS细胞增殖作用与PTEN/Akt信号通路是否相关，本研究对Akt特异性抑制剂哌立福辛干预AGS细胞后PTEN/Akt蛋白的表达进行检测。结果显示PGE2组PTEN蛋白表达较对照组下调，p-Akt蛋白表达较对照组上调。PGE2+anti-miR-21组PTEN蛋白表达较PGE2组上调，p-Akt蛋白表达较PGE2组下调，提示PTEN/Akt参与了miR-21对PGE2促AGS细胞增殖作用的调节。哌立福辛干预后，PGE2对AGS细胞的促增殖作用减弱，间接提示miR-21通过PTEN/Akt介导了PGE2对AGS细胞的促增殖作用。Yang等[17]的研究发现抑制miR-21表达后，PTEN表达上调，提示PTEN可作为控制胃癌发生、发展的靶点。

综上所述，本研究证实PGE2可促进AGS细胞增殖，miR-21可能参与了PGE2促进AGS细胞增殖作用的调节，而这一调节作用可能与PTEN/Akt通路有关。需开展体内动物实验进一步探讨miR-21对胃癌的作用及其机制，为胃癌的防治提供新的生物学靶点。

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(2016-03-02收稿；2016-03-15修回)

MicroRNA-21 Mediates the Promoting of Proliferation of Gastric Cancer Cells by Prostaglandin E2through PTEN/Akt Pathway

ZHOU Hao, ZHANG Shaoren, LIU Hongyan.

Department of Gastroenterology, Jinshan Hospital of Fudan University, Shanghai (201508)Correspondence to: LIU Hongyan, Email: Liuhy1320@163.com

MicroRNAs;Stomach Neoplasms;Prostaglandins E;PTEN/Akt Pathway

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.007

复旦大学附属金山医院院级课题(2013-院743)

#本文通信作者，Email: Liuhy1320@163.com