纤维素酶法提取荸荠皮中多糖的工艺研究

汪建红,李　迪

(1.内江师范学院 化学化工学院,四川内江 641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室,四川内江 641112)



纤维素酶法提取荸荠皮中多糖的工艺研究

汪建红1,2,李迪1

(1.内江师范学院 化学化工学院,四川内江 641112；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室,四川内江 641112)

以低温烘干的荸荠皮为原料,利用纤维素酶法提取荸荠皮中的多糖,通过单因素实验和正交实验考察了pH、酶用量、液料比、酶解温度、酶解时间对多糖提取效果的影响。结果表明:当pH为5,酶用量为2.0%,液料比为30∶1 mL/g,酶解温度为60 ℃,酶解时间为2 h时,得率最高。在此条件下作了5次平行实验,平均得率可达32.33%,远大于相同条件下水提法的得率18.31%,而且实验重现性好。因此,用于荸荠皮中多糖提取的纤维素酶法是一种很有发展前途的提取方法。

纤维素酶,多糖,荸荠皮,提取

荸荠是一种原产于中国的历史悠久、美味可口、营养丰富的水果,深受人们喜爱[1]。但荸荠皮往往被作为垃圾直接抛弃,既污染了环境,又浪费了资源。荸荠皮含有大量的淀粉、多糖、色素、果胶等生物活性物质,尤其是多糖含量十分丰富[2-4]。多糖具有清热开胃、抗肿瘤、抗辐射、增强免疫等药用价值,引起人们的广泛关注[1,2,5]。

多糖的常用提取方法有水浸提法[6-8]、超声波提取法[6,8]、微波提取法[6]、酶法[9-11]等。水浸提法操作简便,但得率低。超声波法和微波法操作简便,条件温和,得率较高,但超声波会导致多糖分解,微波也会破坏多糖结构,而且超声波和微波会对人体带来较大危害,长期接触低剂量的超声波会有致癌的风险。酶法条件温和,操作简便,提取效率高,便于工业化应用。到目前为止文献中[12]仅见到超声波法、水提法提取荸荠多糖的记载,还未见过使用酶法提取荸荠皮多糖的报道。因此,本实验选择酶法提取荸荠皮中的多糖。

常用的酶有纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶等。纤维素酶[13]溶解容易,活性较高,操作简便,后处理容易,因此本实验选择纤维素酶提取荸荠皮中的多糖,并优化提取条件,为其应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

纤维素酶(活力值>15 U/mg,优级纯)上海伯奥生物科技有限公司;葡萄糖标准品(优级纯)成都金山化学试剂有限公司;浓硫酸、苯酚、乙酸、乙酸钠 成都金山化学试剂有限公司均为分析纯;荸荠四川内江。

DFT-100手提式万能高速粉碎机温岭市林大机械有限公司;722型可见分光光度计上海菁华科技仪器公司;CS101-2AB 型电热鼓风干燥箱重庆实验设备厂;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 上海兴创科学仪器设备有限公司;FA2204A型电子天平上海精天电子仪器有限公司;TDL-5-A型低速大容量离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的绘制标准溶液的配制:参照文献方法[14],将葡萄糖标准品于105 ℃干燥至恒重,准确称取此标准品50.00 mg,于50 mL容量瓶中配制1.00 mg/mL的葡萄糖标准溶液,放置备用。

测定波长的选择:参照文献方法[14],准确移取1.00 mL葡萄糖标准溶液,按照苯酚硫酸法显色,并在300～600 nm之间进行扫描,发现488 nm处出现强吸收峰,因此选择488 nm为测定波长。

标准曲线的绘制:参照文献方法[14],分别精密吸取上述标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL于50 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精确吸取上述各溶液2.0 mL,于带刻度试管中,分别加入1.0 mL 6%苯酚溶液,振荡摇匀,缓慢加入5.0 mL浓硫酸,摇匀,于40 ℃水浴中显色30 min,在488 nm 波长处测定吸光度。以被测定的溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,求出直线回归方程。

1.2.2荸荠皮多糖的提取与测定称取2.00 g干荸荠皮粉,在一定pH下,加入一定量的纤维素酶溶液,在一定温度下利用水作溶剂提取一定时间,然后沸水浴(约90 ℃)下灭酶60 min,离心,取上层清液装入100 mL容量瓶中,蒸馏水定容,放置备用。

用移液管准确移取1.0 mL上述提取液于25 mL容量瓶中,用蒸馏水定容。再从上述25 mL容量瓶中用移液管准确移取1.00 mL溶液于10 mL比色管中,定容、摇匀。

从上述10 mL比色管中取2.00 mL溶液于另一10.00 mL比色管中,加入1 mL 6%的苯酚溶液,摇匀,再加入5 mL浓硫酸,摇匀,然后于40 ℃水浴中显色30 min,利用分光光度计,在488 nm处测定其吸光度。根据标准曲线及其回归方程计算提取液中多糖的浓度,多糖的得率按下式计算:

Et(%)=(C×V×N)/M×100

式中Et为得率(%),C为测得的提取液浓度(g/mL),N为稀释倍数,V为提取液体积(mL),M为荸荠皮干粉质量(g)。

1.2.3pH的影响在酶用量(酶用量占荸荠皮粉的质量百分比)0.5%,液料比(V溶剂∶m荸荠皮)15∶1 mL/g,酶解温度40 ℃,酶解时间1 h的条件下,研究了pH(3、4、5、6)对荸荠皮多糖提取效果的影响。

1.2.4酶用量的影响在液料比15∶1 mL/g,前面步骤确定的pH,酶解温度40 ℃,酶解时间1 h的条件下,研究了酶用量占荸荠皮粉的质量百分比(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对荸荠皮多糖提取效果的影响。

1.2.5液料比的影响在前面步骤确定的酶用量、pH,酶解温度40 ℃,酶解时间1 h的条件下,研究了液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)对荸荠皮多糖提取效果的影响。

1.2.6酶解温度的影响在前面步骤确定的酶用量、pH、液料比,酶解时间1 h的条件下,研究了酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)对荸荠皮多糖提取效果的影响。

1.2.7酶解时间的影响在前面步骤确定的酶用量、pH、液料比、酶解温度的条件下,研究了酶解时间(1、2、3、4 h)对荸荠皮多糖提取效果的影响。

1.2.8正交实验参考文献[14]方法,以pH、酶用量、液料比、酶解温度、酶解时间为考察因素,每个因素选取4个水平,使用L16(45)正交表来安排实验,每组实验条件作了三次平行实验。

表1　因素水平表Table 1　The factors and levels chart

1.3数据统计分析

对正交实验结果进行极差分析和方差分析,得出最佳提取工艺条件和因素影响大小顺序。在此最佳工艺条件下重复1.2.2的操作,并在此条件下在不用酶的情况下利用水提法重复1.2.2的操作。

2　结果与分析

2.1标准曲线

多糖标准曲线如图1所示:

图1　多糖标准曲线Fig.1　The standard curve of polysaccharide

从图1可知标准曲线回归方程为A=0.0334C-0.0704,R2=0.9994。

2.2单因素实验

2.2.1pH的影响pH对荸荠皮多糖提取效果的影响如图2所示。

图2　pH的影响Fig.2　Effects of pH

从图2可看到pH在3～5的范围内,荸荠皮多糖的得率随pH的增大而增大,当pH达到5时,得率达最大值;此后随pH的增加,多糖得率却逐渐下降。这是由于pH会影响酶蛋白活性,在一定范围内随pH的增大,纤维素酶的活性逐渐增大,但pH过大时,酶的活性随其升高而减弱。故综合考虑后确定最佳pH=5。

2.2.2酶用量的影响在前面得到的pH=5的基础上,酶用量(酶用量占荸荠皮粉的质量百分比)对荸荠皮多糖提取效果的影响如图3所示。

图3　酶用量的影响Fig.3　Effects of the amount of enzyme

从图3可看出,在酶用量0.5%～2.0%的范围内,多糖得率随酶用量的增加而增加,当达到2.0%时,得率达最大值;此后随酶用量的继续增加,多糖得率不但没增加反而逐渐下降。这是由于酶用量越大,活力值越大,因此更有利于多糖的浸出;但酶用量过大时也会增加被酶催化分解变质的多糖的量。因此选择2.0%的酶用量。

2.2.3液料比的影响液料比对荸荠皮多糖提取效果的影响如图4所示。

图4　液料比的影响Fig.4　Effects of the liquid-solid ratio

从图4可看到,荸荠皮多糖得率随溶剂用量的增加而增加,当液料比达到30∶1 mL/g时,多糖得率达最大值,此后随溶剂用量的增加,多糖得率却逐渐下降。这是由于溶剂量的增加也增加了能溶解的多糖的量,有利于多糖的浸出;但溶剂量的增加,也会降低酶的浓度,使其活性降低。综合考虑选择30∶1 mL/g的液料比。

2.2.4酶解温度的影响酶解温度对荸荠皮多糖提取效果的影响如图5所示。

图5　酶解温度的影响Fig.5　Effects of enzymolysis temperature

从图5可知,在30～50 ℃范围内,多糖得率随酶解温度的上升而增大,当达到50 ℃时,得率达最大;此后,随酶解温度升高,多糖得率却逐渐下降。这是由于在一定范围内酶解温度越高,酶活性越强,多糖分子也越活跃,有利于多糖的浸出,但过高的温度也会降低酶的活性,甚至使酶失活。综合考虑,选择酶解温度50 ℃。

2.2.5酶解时间的影响酶解温度50 ℃的基础上,酶解时间的影响如图6所示。

图6　酶解时间的影响Fig.6　Effects of enzymolysis time

从图6可看到随着酶解时间的延长,多糖得率呈现先上升后下降的趋势,酶解时间2 h时,荸荠皮多糖得率达到最大值。那是由于提取初期,提取液中多糖浓度小,远未达到饱和,对酶的抑制作用也小,因此逐渐上升;当达到2 h后,溶剂中多糖浓度达到较大,接近于饱和状态,对酶的抑制作用也增加;另一方面酶与多糖接触时间的延长也会增加被分解变质的多糖的量。综合考虑,选择2 h的提取时间。

2.3正交实验

按照L16(45)正交表安排的正交实验的结果如表2、表3所示。

表2　L16(45)正交实验设计及结果Table 2　L16(45)orthogonal experimental design and results

从表2可看出,荸荠皮中多糖得率受到了pH、酶用量、液料比、酶解温度、酶解时间这5个因素的交叉影响,各影响的主次次序为pH>液料比>酶解时间>酶解温度>酶用量。最佳水平组合为A3B3C3D4E2,即pH5,酶用量2.0%,溶剂水合荸荠皮粉的液料比30∶1 mL/g,酶解温度60 ℃,酶解时间2 h。

表3　正交实验结果方差分析Table 3　Variance analysis of the orthogonal experiment results

注:F0.05(3,3)=9.280,F0.01(3,3)=29.500,*代表p<0.05为影响显著,**代表p<0.01为影响极显著。

为了进一步确定实验因子的可信度,对荸荠皮中多糖得率的正交实验结果的方差分析见表3。从表3可看到,在荸荠皮多糖所选择提取工艺的正交实验所选取因素和水平范围内,因素A即pH的影响达到了极显著的水平(p<0.01),因素B、C、D、E的影响未达到显著水平。而F值结果表明,方差分析结果与直观的极差分析结果一致。

对正交实验结果进行5次平行实验验证,结果荸荠皮中多糖的得率分别为32.23%、32.35%、32.16%、32.47%、32.45%,平均值为32.33%,正交优化条件可行。

2.4两种提取方法的比较

表4列举了并比较了两种提取方法提取荸荠皮中多糖的情况。

表4　两种提取方法下的荸荠皮多糖提取情况Table 4　The extracting effects of polysaccharide in water chestnut peel by two kinds of extracting methods

从表4可知,纤维素酶法的多糖得率远大于相同条件下的水提法,其原因就在于纤维素酶对荸荠皮组织的破壁作用使得多糖更容易浸出,更利于提取。

3　结论

本文通过设计单因素实验和正交实验,得出了纤维素酶法提取荸荠皮中多糖的实验中,影响荸荠皮中多糖得率指标的因素大小顺序为:pH>液料比>酶解时间>酶解温度>酶用量,提取的最佳工艺条件为:pH5,酶用量2.0%,溶剂水合荸荠皮粉的液料比30∶1 mL/g,酶解温度60 ℃,酶解时间2 h。通过平行实验的验证可知,该方法不但得率较高,而且实验重现性好,也说明正交实验得出的结论是正确的。同不使用酶的水提法相比,纤维素酶法具有条件温和,得率较高的优点。该研究结果对于天然产物中有效成分的提取研究具有一定的参考价值。

[1]王薇. 荸荠的保健功能及加工利用[J]. 食品与药品,2005,7(4A):45-48.

[2]赵广河,陈振林. 荸荠活性成分与功能作用研究进展[J]. 食品研究与开发,2011,32(9):235-237.

[3]孔进喜,韩文芳,吕广英,等. 荸荠食品加工研究进展[J]. 保鲜与加工,2011,11(1):43-46.

[4]江文,李杨瑞,杨丽涛,等. 荸荠球茎主要性状观察及营养品质分析[J]. 中国蔬菜,2009,(2):51-54.

[5]蔡健. 荸荠的营养保健和加工利用[J]. 中国食物与营养,2005,(2):40-42.

[6]陈建平,汤化琪,武旭芳,等. 中蒙药多糖提取方法及工艺研究[J]. 内蒙古医科大学学报,2013,35(2):158-162.

[7]尚喜雨. 水提法·酶法提取铁皮石斛多糖的比较研究[J]. 安徽农业科学,2010,38(18):9787-9788.

[8]徐雅琴,崔崇士,王洪伟,等. 南瓜多糖提取方法研究[J]. 食品工业,2006,(5):45-47.

[9]孟宪军,朱金艳,孙希云,等. 酶法优化蓝莓多糖的提取工艺[J]. 食品工业科技,2009,30(3):185-187.

[10]国立东,王丽群,刘晓艳. 枸杞多糖提取技术研究进展[J].黑龙江医药,2012,25(6):835-837.

[11]李波,宋江良,赵森,等. 酶法提取香菇多糖工艺研究[J].食品科学,2007,28(9):274-277.

[12]王忠合,王军,黎健文. 荸荠多糖的提取及特性研究[J]. 食品科技,2012,37(7):196-198.

[13]田瑞红,江连洲,胡少新,等. 超声波酶法提取豆渣中水溶性多糖条件的优化[J].食品工业科技,2011,32(11):305-308.

[14]张海容,白娟,魏增云,等. 超声萃取-响应面法优化淡竹叶多糖提取方法研究[J]. 化学研究与应用,2013,25(3):303-310.

Study on the extraction technology of polysaccharide in water chestnut peel by cellulase

WANG Jian-hong1,2,LI Di1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Neijiang Normal University,Neijiang 641112,China;2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling,Neijiang 641112,China)

With low-temperature baked water chestnut peel as raw material,the polysaccharide was extracted from the water chestnut peel by cellulase. The effect of the pH,the amount of cellulase,the liquid-solid ratio,the enzymolysis temperature,and the enzymolysis time,on the extraction of polysaccharide,were studied by the single factor experiments and the orthogonal tests. The results showed that when the pH was 5,the amount of cellulase was 2.0%,the liquid-solid ratio was 30∶1 mL/g,the enzymolysis temperature was 60 ℃,the enzymolysis time was 2 h,the extraction rate reached the maximum. Under the optimal conditions,five parallel experiments were carried out and the extraction rate could reach 32.33%,which was highly more than the extraction rate of 18.31% of water extraction method at the same conditions. The reproducibility of the experiments was good. So the cellulase method used for extraction of polysaccharide in water chestnut peel,was one kind of promising extracting method.

cellulase;polysaccharide;water chestnut peel;extraction

2015-08-04

汪建红(1981-)，男，硕士，高级实验师，主要从事天然产物的提取、纯化及性质等方面的研究，E-mail:cunhua2@126.com。

四川省教育厅重点项目(15ZA0291 )。

TS255.36

B

1002-0306(2016)05-0248-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.040