发酵对南酸枣饮料抗氧化性的影响

李　俶,戴涛涛,程　超,王谢祎,刘成梅,陈　军,*,刘继延

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.江西齐云山食品有限公司,江西赣州 341000)



发酵对南酸枣饮料抗氧化性的影响

李俶1,戴涛涛1,程超1,王谢祎1,刘成梅1,陈军1,*,刘继延2

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.江西齐云山食品有限公司,江西赣州 341000)

以南酸枣为主要原料,利用驯化后的乳酸菌(嗜热链球菌,保加利亚乳杆菌)对其进行发酵,制备南酸枣功能型乳酸菌饮料。采用福林酚法、硝酸铝-亚硝酸钠法测定发酵液前后游离酚、游离黄酮的含量变化;采用三种不同抗氧化模型来考察南酸枣功能型乳酸菌饮料发酵前后抗氧化性变化。研究表明,经发酵后,发酵液中的游离酚、游离黄酮含量对比发酵前有明显升高,分别为发酵前的1.3和1.1倍;南酸枣功能型乳酸菌饮料具有较强的抗氧化性,发酵前后DPPH·清除率的IC50分别为0.137、0.185 mL/mL,ABTS+·清除率的IC50分别为0.012、0.015 mL/mL,发酵后的抗氧化能力均为发酵前1.1～1.4倍;发酵液铁离子还原能力是发酵前的1.4～1.7倍;且均存在显著性差异(p<0.05)。

南酸枣,发酵,抗氧化活性,饮料

越来越多的研究表明,食品经乳酸菌发酵后,能提高维生素、有机酸、氨基酸等营养成分的含量与种类,并且更易被人体消化吸收[1]。郑欣等[2]用多种益生乳酸菌发酵荔枝汁后,其维生素C、总酚、胞外多糖、果糖等营养成分含量均有所增加。此外,乳酸菌饮料具有维持消化道微生物菌群平衡功效,有利于人体消化和营养吸收。乳酸菌饮料风味独特,深受消费者喜爱。近年来,开发与乳酸菌相关的功能性食品已然成为研究的热点之一[3-4]。目前,市售的乳酸菌饮料的品种较少,而向其中添加不同风味的营养物质来开发乳酸菌饮料新产品已成为一种必然的研究方向。

南酸枣(Choerospondiasaxillaris),又名五眼果、山枣等,为漆树科(Anacardiaceae)南酸枣属(ChoerospondiasBurttetHill)。南酸枣主要分布在印度、中南半岛以及我国气候条件、土壤条件适宜的地区,如江西、湖南、浙江等地[5]。南酸枣的营养成分丰富,其果肉的蛋白质含量约为0.92%～1.48%,有机酸含量可达 5.22%～8.13%[6];另外还含有丰富的Ca、Fe、Zn、Cu、P等矿物元素[7]及多种生物活性物质[8],如槲皮素、鞣花酸、没食子酸等。南酸枣的干燥成果是蒙药的习用药材,具有治疗心律失常[9]和保护心肌缺血等心血管疾病的作用[10],有研究认为南酸枣果实中的黄酮是其主要的功能成分[11]。在体内、体外的抗氧化性实验研究中,南酸枣的水提物均表现出较好的抗氧化能力[11]。

罗登宏[12]采用野生南酸枣为主要原料制备了发酵保健饮料,此饮料香气纯正,口感协调柔和,酸甜可口,营养丰富,具有一定的保健功效。刘晓庚等[13]采用南酸枣鲜果为主要原料,制备了纯天然的南酸枣汁保健饮料。基于南酸枣独有的风味,本研究以南酸枣为主要原料,利用驯化后的乳酸菌发酵得到南酸枣风味乳酸菌饮料,同时研究发酵前、后样液中游离酚、游离黄酮含量及其抗氧化性的变化,为南酸枣功能型乳酸菌饮料工艺优化和营养强化提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

南酸枣鲜果由江西齐云山食品有限公司提供;脱脂奶粉购买自内蒙古伊利实业集团股份有限公司;嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌购买自北京川秀科技有限公司;抗坏血酸标准品(>99.9%)、TPTZ(>99%)、DPPH(>97%)、ABTS(≥98%)均购买自美国Sigma公司;儿茶素、没食子酸标准品购买自阿拉丁试剂有限公司;福林酚试剂购买自上海蓝季科技发展有限公司。

FD-1冷冻干燥机北京德天佑科技发展有限公司;DFY-500型植物粉碎机大德药剂有限公司;HWS-250型恒温恒湿培养箱上海森信实验仪器有限公司;LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;T6新世纪紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1南酸枣饮料制造工艺流程

1.2.2南酸枣功能型乳酸菌饮料制造工艺流程

同1.2.1冷却到40 ℃左右后接种乳酸菌(嗜热链球菌,保加利亚乳杆菌)进行发酵,接种量为3%,发酵时间为7 h,发酵温度为40 ℃,发酵结束后添加复配稳定剂:果胶添加量0.075%,黄原胶添加量0.020%,羧甲基纤维素钠(CMC)添加量0.025%,得到南酸枣乳酸菌发酵饮料。

1.2.3功能型饮料游离酚含量的测定游离酚含量的测定方法参照Alothman等[14]的实验方法并稍作了修改,标准曲线的绘制及样品的测定方法具体如下:

没食子酸标准曲线的绘制:精确称量0.2000 g没食子酸,蒸馏水溶解,转移至50 mL容量瓶,定容。分别移取0.50、1.00、1.50、2.50、5.00 mL到50 mL容量瓶中,蒸馏水定容。从上述标准溶液中分别移取0.10 mL加入到50 mL容量瓶中,再分别加入30 mL去离子水,混合均匀后加入2.5 mL福林酚试剂,混匀,在5～8 min内,加入2 mL 7.5%的NaCO3溶液,混匀,定容。室温下避光放置2 h后,以蒸馏水为空白参比,于760 nm处测定吸光度。以标准样液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样液的测定:准确移取0.10 mL发酵前后样液于50 mL容量瓶中,按照上述操作执行,于760 nm处测定吸光度,并根据回归方程计算样液中游离酚的含量(以没食子酸当量(GAE)计)。

1.2.4功能型饮料游离黄酮含量的测定游离黄酮含量的测定方法参照Yao等[15]的实验方法并稍作了修改,标准曲线的绘制及样品的测定方法具体如下:

儿茶素标准曲线的绘制:准确移取0.1 mg/mL儿茶素标品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,加入适量蒸馏水后,再加入0.05 g/mL NaNO2溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,加0.10 g/mL Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,加0.04 g/mL NaOH溶液4 mL,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,放置15 min,以蒸馏水为空白参比,于510 nm处测定吸光度。以标准样液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样液的测定:准确移取0.10 mL发酵前后样液于10 mL容量瓶中,按照上述操作执行,于510 nm处测定吸光度,并根据回归方程计算样液中黄酮的含量(以儿茶素当量(CE)计)。

1.2.5DPPH·清除能力游离黄酮含量的测定方法参照Cagno等[16]的实验方法并稍作了修改,标准曲线的绘制及样品的测定方法具体如下:

分别配制系列浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL/mL(每mL溶液中含有多少mL原液,下同)发酵前后样液。按表1加样,充分振荡后室温下于暗处反应30 min后,室温下6000 r/min离心10 min,取上清液于515 nm处测定吸光值。以样液浓度和清除率做标准曲线,求IC50值。

式中,A0:空白吸光值;A1:样液吸光值。

1.2.6ABTS+·清除能力ABTS+·反应液:将7 mmol/L的ABTS+·溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合,制备ABTS+·储备液,避光保存12～16 h。使用前先用无水乙醇将其稀释成工作液,要求其在30 ℃、734 nm波长条件下吸光度为0.7±0.02[17]。

表1　DPPH·清除实验加样设计Table 1　Dosages of DPPH radical-scavenging activity method

分别配制系列浓度为0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mL/mL的发酵前、后样液,按表2加样,混匀后反应6 min,于734 nm处测定其吸光度,以同等体积蒸馏水为阴性对照。以样液浓度和清除率做标准曲线,求IC50值。

式中,A1:加样液后测定的吸光度;A0:阴性对照的吸光度;A10:蒸馏水代替ABTS+·加入样液后测定的吸光度。

表2　ABTS+·清除实验加样设计Table 2　Dosages of ABTS radical-scavenging activity method

1.2.7铁离子还原能力游离黄酮含量的测定方法参照Benzie等[18]的实验方法并稍作了修改,标准曲线的绘制及样品的测定方法具体如下:

标准曲线的绘制:准确吸取0.1 mL浓度为0.025、0.050、0.075、0.100、0.150 mg/mL的抗坏血酸溶液,加入3.9 mL的FRAP溶液(2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ溶液和2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液和25 mL 0.3 mol/L的醋酸缓冲液混合),混匀后升温至37 ℃,保温10 min后在593 nm下测定吸光度。以抗坏血酸溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。

样液测定:分别准确吸取0.1 mL浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL/mL的发酵前、后样液,加入3.9 mL的FRAP溶液(2.5 mL 10 mmol/L的TPTZ溶液和2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液和25 mL 0.3 mol/L的醋酸缓冲液混合),混匀后于37 ℃反应10 min后,于593 nm处测定吸光度,以蒸馏水为空白参比,样液抗氧化活性以达到相同吸光度所需的抗坏血酸的浓度表示。

1.3统计分析方法

2　结果与分析

2.1 游离酚含量

根据没食子酸标准曲线,得其线性回归方程为y=0.1693x+0.0006[(x为没食子酸质量浓度(mg/mL),y为吸光度(A))],R2=0.9996。从图1中可以看出,发酵前后样液游离酚含量为1245.3、1620.3μg GAE/mL,发酵后的样液中游离酚类物质含量明显增加,约为发酵前的1.3倍,发酵前、后样液间的游离酚含量存在显著性差异(p<0.05),乳酸菌发酵后的南酸枣汁中游离酚含量显著性增加,这可能是其中一些结合态的多酚被乳酸菌产生的糖苷酶或酯酶水解[19],转化成游离多酚,进而使发酵液中的游离多酚含量增加。微生物酶类,如葡糖甘酶、淀粉酶等可以水解葡萄糖苷,分解植物细胞壁或淀粉,从而促进多酚类物质的释放与合成[20],使得游离酚含量增加。发酵过程中,蛋白质水解活性增强,可分解酚-肽复合物,从而释放结合态酚类物质,使其含量增加[21]。此外,聚合酚类物质也可能通过发酵过程中的酸水解反应生成简单酚类物质,使游离酚含量增加[20]。

图1　发酵前后饮料游离多酚含量Fig.1　The free phenolic content of unfermented and fermented beverage注:图中不同字母间差异显著(p<0.05),图2、图4、图6同。

2.2游离黄酮含量测定

根据儿茶素标准曲线,得其线性回归方程为N=43.800M+0.0048[(M为儿茶素含量(mg/mL),N为吸光度)],R2=0.9999。图2中可以看出,发酵前后样液游离黄酮含量分别为6.81、7.68 μg CE/mL,发酵后的样液中游离黄酮含量明显增加,约为发酵前的1.1倍,发酵前、后样液对比,其游离黄酮含量存在显著性差异(p<0.05),游离多酚含量的增加导致游离黄酮含量的增加。

图2　发酵前后饮料游离黄酮含量Fig.2　The free flavonoids content of unfermented and fermented beverage

2.3DPPH自由基清除能力

南酸枣果实中的总多酚、黄酮、抗坏血酸和其他一些物质均具有清除DPPH·的能力,DPPH·清除能力的高低反映了发酵前后样液的抗氧化能力强弱[19]。图3为发酵前、后样液的DPPH·清除率的对比图。从图中可以看出,发酵前、后的DPPH·清除能力均随着浓度的升高而逐渐增强,且发酵后样液的DPPH·清除能力有很大提高,约为发酵前的1.1～1.4倍。如图4所示,发酵前后样液的DPPH·清除率的IC50分别为0.185、0.137 mL/mL,经方差分析可知,其IC50存在显著性差异(p<0.05)。这可能是经乳酸菌发酵后,其中一些糖基化酚类物质被乳酸菌产生的糖苷酶去糖基,从而使其抗氧化性有所增强[22]。发酵过程中,可能还会引起一些抗氧化性成分结构上的变化[20],生成一些具有更强给电子能力的成分[21],使其抗氧化能力增强。

表3　发酵前后样液的铁离子还原能力Table 3　Ferric reducing/antioxidant power of unfermented and fermented beverage

注:表中数值为平均值±标准偏差(n=3)。各列不同字母间差异显著(p<0.05)。

图3　发酵前后样液的DPPH·清除能力Fig.3　The DPPH radical-scavenging activity of non-fermented and fermented beverage

图4　发酵前后样液的抗氧化能力Fig.4　IC50 values in antioxidant properties of unfermented and fermented beverage注:IC50,半抑制浓度,当清除率达50%时的有效浓度。 IC50值通过线性回归分析所得，图6同。

2.4ABTS+自由基清除能力

图5为发酵前、后样液的ABTS+·清除率的对比图。从图中可以看出,发酵前、后的ABTS+·清除能力均随着浓度的升高而逐渐增强,且发酵后样液的ABTS+·清除能力有很大提高,约为发酵前的1.1～1.3倍。如图6所示,发酵前后样液的ABTS+·清除率的IC50分别为0.015、0.012 mL/mL,经方差分析可知,其IC50存在显著性差异(p<0.05)。发酵后的样液具有更强的自由基清除能力,可能是由于发酵过程中游离酚和黄酮苷元的含量增加,而黄酮苷元可以更有效地终止自由基反应[23-24]。

图5　发酵前后样液的ABTS+清除能力Fig.5　The ABTS radical-scavenging activity of non-fermented and fermented beverage

图6　发酵前后样液的抗氧化能力Fig.6　IC50 values in antioxidant properties of unfermented and fermented beverage

2.5铁离子还原能力

根据抗坏血酸标准曲线,得其线性回归方程为y=7.4535x-0.0061(x为抗坏血酸浓度/(mg/mL),y为吸光度(A)),R2=0.9997。从表3中可以看出,发酵前、后的铁离子还原能力均随着浓度的升高而逐渐增强,且发酵后样液的铁离子还原能力有很大提高,约为发酵前的1.4～1.7倍。经方差分析可知,发酵前、后样液相比,其铁离子还原能力存在显著性差异(p<0.05)。Vadivel等[25]研究认为铁离子还原能力与酚类物质的含量有关,研究结果显示,经乳酸菌发酵后,结合态的多酚被乳酸菌产生的糖苷酶或者酯酶水解[26-27],使发酵液中游离酚含量增加,从而提高了发酵后样液的抗氧化能力。

3　结论

以南酸枣为主要原料,利用驯化后的乳酸菌进行发酵制成南酸枣功能性乳酸菌饮料,研究表明:经发酵后,样液中的游离酚、游离黄酮含量明显升高,分别为发酵前的1.3倍、1.1倍,这可能是结合态的多酚转化为游离多酚和黄酮,另外酶的作用促使多酚物质的生成与释放。

对南酸枣功能性乳酸菌饮料的抗氧化效果进行了初步研究。结果表明:南酸枣功能性乳酸菌饮料具有较强的抗氧化性,发酵后样液的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力均是发酵前的1.1～1.4倍;发酵后样液的铁离子还原能力为发酵前的1.4～1.7倍;且均存在显著性差异。经过发酵后,南酸枣饮料的抗氧化性明显增强。然而,游离酚、游离黄酮含量的增加仅仅只是引起其抗氧化性增强的原因之一。发酵过程中,可能还会引起一些抗氧化性成分结构上的变化,生成一些具有更强给电子能力的成分使其抗氧化能力增强。

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Fermentation effects on antioxidant activity ofChoerospondiasaxillarisbeverage

LI Ti1,DAI Tao-tao1,CHENG Chao1,WANG Xie-yi1,LIU Cheng-mei1,CHEN Jun1,*,LIU Ji-yan2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2. Jiangxi Qiyunshan Food Co.,LTD.,Ganzhou 341000,China)

Domesticated bacteria(StreptococcusthermophilusandLactobacillusbulgaricus)were utilized to fermentChoerospondiasaxillaristo produce functionalLactobacillusbeverages ofChoerospondiasaxillaris. The free phenolic and flavonoid compounds of beverages of fermentation and unfermentation were determined by the method of Folin-Ciocaileu and Al(NO3)3-NaNO2. Three antioxidant model were used to study the change of antioxidant activity of the beverages after fermention ofChoerospondiasaxillaris. The results showed that the content of the free phenolic and flavonoid compounds were increased to 1.3 times,1.1 times respectively after fermentation compared to that of unfermented one. It was found that the antioxidant activity of the beverage was enhanced obviously. The IC50of DPPH radical-scavenging activity of fermented and unfermented beverages were 0.137,0.185 mL/mL,respectively. The IC50of ABTS radical-scavenging activity of fermented and unfermented beverages were 0.012,0.015 mL/mL,respectively. The antioxidant activity was increased to 1.1～1.4 times,and the ferric reducing/antioxidant ability was increased to 1.4～1.7 times by fermentation. Besides,all the changes showed significant difference(p<0.05).

Choerospondiasaxillaris;fermentation;antioxidant activity;beverage

2015-08-04

李俶(1971-),女,博士,教授,主要从事天然产物的提取与应用,E-mail:liti@ncu.edu.cn。

陈军(1986-),男,博士,助理研究员,研究方向为食品(含生物质)资源的开发利用,E-mail:chen_jun1986@126.com。

国家自然科学基金(31460394);江西省支撑计划(20121BBF60039)。

TS272.7

B

1002-0306(2016)05-0054-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.002