喷雾干燥法制备牡蛎肽粉的体内抗氧化活性研究

许　旻,朱良松,熊何健,苏　捷,刘淑集,刘智禹,*

(1.福建省水产研究所,国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门),福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心,福建厦门 361013;2.集美大学,福建厦门 361021;3.杭州丘比食品有限公司,浙江杭州 310018)



喷雾干燥法制备牡蛎肽粉的体内抗氧化活性研究

许旻1,朱良松2,3,熊何健2,苏捷1,刘淑集1,刘智禹1,*

(1.福建省水产研究所,国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门),福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心,福建厦门 361013;2.集美大学,福建厦门 361021;3.杭州丘比食品有限公司,浙江杭州 310018)

研究喷雾干燥制备牡蛎肽粉对体内抗氧化活性的影响。以新鲜葡萄牙牡蛎为原料,通过选择性复合酶解后喷雾干燥制备牡蛎肽粉,分别测定小鼠丙二醛(MDA)、蛋白质羰基、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量等指标考察牡蛎肽粉对小鼠抗氧化活性的影响。结果显示,与模型对照组相比,经过喷雾干燥后的牡蛎肽粉不同剂量组均可极显著地降低小鼠血清丙二醛含量和蛋白质羰基含量(p<0.01),并显著提高超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽的含量(p<0.01)。结果表明喷雾干燥制备的牡蛎肽粉具有良好的体内抗氧化作用。

牡蛎,多肽,喷雾干燥,抗氧化

氧化衰老一直以来都是人们关注的健康问题。机体在生命过程中时刻都在产生自由基,如果自由基产生过多或者清除过慢,不断地积累,就会攻击细胞器和生命大分子物质,加速机体损伤并引发各种疾病[1]。机体通过酶抗氧化剂或非酶抗氧化剂等防御系统可消化和清除自由基的产生。随着科学的进步,科学家越来越多的使用外源性抗氧化剂达到抗氧化目的。尤其是最近几十年,从植物、动物中提取具有显著地抗氧化活性的多酚[2]、黄酮[3]、多肽[4]等天然产物,广泛用于食品添加剂、药品和保健食品的生产。

表1　牡蛎肽粉对小鼠体重的影响Table 1　The effects of Oyster peptide on body weight of mice

牡蛎是一种营养价值较高的海洋贝类,含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素及微量元素[5]。牡蛎中提取的生物活性肽在降压、抗肿瘤、抗氧化等方面有显著的活性[6-8]。但是目前国内外研究主要集中在牡蛎酶解液的体内抗氧化活性[6,8-15],而对加工条件及其抗氧化活性影响却鲜有报道,由于多肽中的氨基酸组成复杂,这使得其在生产、应用和储存过程中发生氧化、降解等作用影响肽的稳定性,甚至有可能导致活性完全丧失[16]。因此本实验根据实际生产情况,利用喷雾干燥制得牡蛎肽粉成品,但由于短时间高温可能会造成蛋白活性发生变化,因此本文探讨喷雾干燥粉末对小鼠体内抗氧化能力的影响,为开发具有抗氧化活性的保健产品提供依据,为后续研究喷雾干燥制得牡蛎肽粉对其他活性机理的影响奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜葡萄牙牡蛎厦门第八市场;胰蛋白酶(2.5×105U/g)，风味蛋白酶(1.5×104U/g)南宁庞博生物工程有限公司；SPF级雄性ICR小鼠200只,18～22 g上海斯莱克实验动物有限责任公司;小鼠饲料北京华阜康生物科技股份有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2009-0008京饲审(2009)06170。

丙二醛测定试剂盒、蛋白质羰基测定试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒、还原型谷胱甘肽测定试剂盒、考马斯亮蓝测定试剂盒南京建成科技有限公司。

S10组织匀浆机宁波新芝生物;HH-6型恒温水浴锅国华电器有限公司;陶瓷膜机组、超滤膜机组(截留分子量5 ku)、纳滤膜机组(卷式纳滤膜,最小截留分子量150)世达膜科技(厦门)有限公司;YS-ZS-420真空包装机杭州永创智能设备股份有限公司;XF0.3-2型喷雾干燥器常州市新业制粒干燥设备有限公司;Cintra6型紫外可见分光光度计澳大利亚科学仪器设备有限公司;Centrifuge 5804 R型高速冷冻离心机德国Eppendorf公司;XH-D漩涡混匀器上海比朗仪器制造有限公司;BS4202S电子分析天平德国赛多利斯集团。

1.2实验方法

1.2.1牡蛎匀浆的制备将新鲜牡蛎清洗沥干后打浆,烘干成粉末。

1.2.2牡蛎肽粉的制备将新鲜牡蛎清洗沥干后打浆→按1∶2的比例加水→加酶量胰蛋白酶7500 U/g、风味蛋白酶450 U/g→温度50 ℃、pH8.0、时间4 h→离心取上清→陶瓷膜除杂→超滤膜过滤获得小于5 ku分子量的多肽→纳滤膜浓缩至固形物含量达10%→喷雾干燥(进风温度180 ℃,出风温度80 ℃)→得到牡蛎活性肽粉→真空包装低温保存。

1.2.3动物分组及给药方法SPF级雄性ICR小鼠60只,18～22 g,适应性喂养一周,随机分为6组,每组10只。分别为:空白对照组(0.5 mL生理盐水)、模型对照组(0.5 mL生理盐水)、牡蛎匀浆组(2.0 g/kg·BW牡蛎匀浆)、牡蛎肽粉低剂量组(0.5 g/kg·BW牡蛎肽粉)、牡蛎肽粉中剂量组(1.0 g/kg·BW牡蛎肽粉)、牡蛎肽粉高剂量组(2.0 g/kg·BW牡蛎肽粉)。同时饲喂小鼠维持饲料,自由饮水,连续喂养30 d,末次灌胃后,模型对照组、牡蛎匀浆组和牡蛎肽粉低剂量组、中剂量组、高剂量组分别禁食过夜16 h,然后灌胃50%乙醇12 mL/kg·BW,6 h后拔眼球取血和肝脏。血液放置于4 ℃冰箱过夜沉降,4000 r/min离心分离后取血清;取肝脏经生理盐水漂洗后滤纸吸干,加入生理盐水在冰水浴下匀浆,离心取上清备用[17]。

1.2.4指标测定按照试剂盒指定方法测定丙二醛(MDA)、蛋白质羰基含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及还原性谷胱甘肽(GSH)含量。

2　结果与讨论

2.1牡蛎肽粉对小鼠体重的影响

表1表明,各组小鼠体重在实验前、后组间无显著性差异(p>0.05),不具有统计学意义。说明牡蛎肽粉对小鼠的生长发育和一般健康情况无不良影响。

2.2牡蛎肽粉对小鼠丙二醛含量的影响

表2　牡蛎肽粉对小鼠血清丙二醛含量的影响Table 2　The effected of Oyster peptide on serum MDA in mice

注:“*”与空白对照组比,p<0.05;“**”与空白对照组比,p<0.01;“#”与模型对照组比,p<0.05;“##”与模型对照组比,p<0.01，表3～表5同。

表3　牡蛎肽粉对小鼠血清SOD活力的影响Table 3　The effects of Oyster peptide on serum SOD activity in mice

表4　牡蛎肽粉对小鼠蛋白质羰基含量的影响Table 4　The effects of Oyster peptide on protein carbonyl in mice

表5　牡蛎肽粉对小鼠GSH含量的影响Table 5　The effects of Oyster peptide on GSH in mice

丙二醛是脂质过氧化过程中产生的活性羰基类物质,其含量高低可以反映机体脂质过氧化水平,在一定程度上间接反映机体受自由基攻击的严重程度。

表2可以看出,与空白对照组相比,模型对照组小鼠血清中的丙二醛含量极显著增加(p<0.01),说明小鼠氧化衰老模型建立成功。与模型对照组相比,牡蛎匀浆组和牡蛎肽粉低、中、高三个剂量组的血清丙二醛含量都极显著降低(p<0.01),说明牡蛎匀浆组和牡蛎肽粉都能有效地降低小鼠血清丙二醛含量。随着牡蛎肽粉剂量的增加,丙二醛的含量呈现递减的趋势,可以看出小鼠血清丙二醛含量与牡蛎肽粉剂量具有相关性。与空白对照组相比,牡蛎肽粉高剂量组显著降低(p<0.01)。结果说明喷雾干燥后的牡蛎肽粉可以降低小鼠体内丙二醛含量,具有突出的修复机体衰老损伤的治疗效力。

2.3牡蛎肽粉对小鼠超氧化物歧化酶活力的影响

从表3可以看出,与空白对照组相比,模型对照组小鼠血清SOD活力极显著降低(p<0.01),说明造模成功。与模型对照组相比,牡蛎匀浆组和牡蛎肽粉低、中、高三个剂量组均能极显著提高小鼠SOD活力(p<0.01),并且SOD活力与牡蛎肽粉剂量具有相关性。但与正常组相比,还有明显的差距(p<0.01)。结果说明喷雾干燥后的牡蛎肽粉对小鼠的急性氧化损伤具有良好的预防作用,但不具备修复SOD活力降低的作用。

2.4牡蛎肽粉对小鼠蛋白质羰基含量的影响

蛋白质羰基化是指氨基酸残基侧链中的氨基或亚氨基受到氧自由基攻击最后转变成醛基,并释放NH3+的过程。测定蛋白的羰基化水平是评价蛋白质总氧化水平的常用方法。

表4蛋白质羰基含量测定结果显示,与空白对照组相比,模型对照组的小鼠肝脏蛋白质羰基含量有极显著的增加(p<0.01),说明造模成功。与模型对照组相比,牡蛎匀浆组和牡蛎肽粉低、中、高剂量组的蛋白质羰基含量都极显著降低(p<0.01),可以看出牡蛎匀浆和牡蛎肽粉都可以抑制蛋白质氧化,降低蛋白质羰基的含量。牡蛎肽粉的效果要明显优于牡蛎匀浆粉,并呈剂量依赖性。上述结果表明,喷雾干燥后的牡蛎肽粉能够减少蛋白羰基化合物的形成,提高小鼠抗氧化损伤的能力。

2.5牡蛎肽粉对小鼠还原型谷胱甘肽含量的影响

谷胱甘肽是一种低分子清除剂,它可清除O2-、H2O2、LOOH,是GSH-PX和GST两种酶类的底物,为这2种酶分解氢过氧化物所必需,它能稳定含巯基的酶,和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤,GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。

表5表明,与空白对照组相比,模型对照组小鼠肝脏GSH含量极显著降低(p<0.01)。与模型对照组相比,牡蛎肽粉高剂量组的GSH含量有极显著的增加(p<0.01),但与空白对照组相比没有显著性差异。机体代谢过程中产生的过量自由基会损伤生物膜、侵袭生物大分子物质、促进机体衰老等一系列不良反应的发生,GSH具有清除自由基的能力,表5中高剂量的牡蛎肽粉可以极显著的提高小鼠GSH含量,可见高剂量组的牡蛎肽粉具有突出的修复机体衰老损伤的治疗效力。

3　结论

本研究用复合酶解后喷雾干燥制备牡蛎肽粉,通过对小鼠生化指标的测定喷雾干燥的牡蛎肽粉对小鼠体内抗氧化的活性作用。结果表明,喷雾干燥制备的牡蛎肽粉对降低小鼠MDA和蛋白质羰基含量、增加SOD活力和GSH含量等方面均具有显著效果,具有很好的抗氧化效果。可能是喷雾干燥过程中,提取液被雾化为体积极小的液滴,在热气流充分接触的极短时间内迅速蒸发水分,带走了液滴中大量的热量,肽粉实际受热较低,受热时间短,因此热敏成分破坏少。

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Preparation andinvivoantioxidant activity of spray-dried peptides fromCrassostreaangulate

XU Min1,ZHU Liang-song2,3,XIONG He-jian2,SU Jie1,LIU Shu-ji1,LIU Zhi-yu1,*

(1. Fisheries Research Institute of Fujian,National Research and Development Center for Marine Fish Processing(Xiamen),Key Laboratory of Cutivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province,Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361013,China;2. Jimei University,Xiamen 361021,China;3. Hangzhou kewpie Corporation,Hangzhou 310018,China)

The preparation andinvivoantioxidant activity of peptides from the protein hydrolysate of oysters were investigated. FreshCrassostreaangulatawere hydrolyzed by a commercial mixture of proteases and spray-dried method to produce oyster peptides. The levels of malondialdehyde(MDA),protein carbonyls(PC)as well as the activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione(GSH)were evaluated for their antioxidant activity of oysters peptides. The results showed that MDA and PC levels in oyster peptides group were significantly decreased(p<0.01),while SOD and GSH level were significantly increased compared with control group(p<0.01). These results indicated that the antioxidant peptide fractions of spray-dried oyster product exhibited strong antioxidant activityinvivo.

oyster;peptides;spray drying;antioxidant

2015-08-04

许旻(1987-)，女，硕士，助理研究员，研究方向:海洋生物活性评价，E-mail:xumin1315@foxmail.com。

刘智禹(1971-)，男，博士，教授级高工，研究方向：水产品加工与综合利用研究，E-mail:13906008638@163.com。

福建省科技重大专项(2014NZ0001-1)；厦门市海洋经济创新发展区域示范项目(12CZP001SF02)；福建省海洋高新产业发展专项；福建省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1003-10)；福建省水产研究所青年基金项目(2014fjscq01)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)05-0361-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.065