电离辐射对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

王　立　张力元　冀胜军　季　江　冷　红苏玉华

·短篇论著·

电离辐射对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

王立1张力元2冀胜军3季江2冷红2苏玉华2

目的： 明确电离辐射对瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFb）增殖的影响。方法： MTT比色法、流式细胞仪检测不同剂量电离辐射照射前后KFb形态、增殖和存活力变化；通过测定培养基上清液中羟脯氨酸含量，明确处理前后胶原总体水平变化。结果： 4Gy X-Rays作用72 h后，KFb增殖抑制率为（47.88±1.82）%高于正常皮肤成纤维细胞（39.86±0.07）%（P＜0.05）；KFb细胞的形态发生了明显的变化，KFb细胞培养上清液中羟脯氨酸含量照射72 h后为（11.749±0.9428）μg/mL高于照射前的（18.689 ±0.8484）μg/mL（P＜0.05）。结论： 电离辐射能够抑制KFb细胞的增殖及胶原的产生。

电离辐射； 瘢痕疙瘩成纤维细胞； 胶原

瘢痕疙瘩是遗传易感性患者皮肤损伤后组织异常修复的结果，对各种治疗抵抗，由于其发病机制尚不完全清楚，目前已成为皮肤科和整形美容外科治疗较为棘手的难题之一。主要治疗方法有手术切除，放疗，药物治疗，压迫治疗，硅胶敷贴，激光及冷冻治疗等。但迄今为止，各种方法治疗后都存在一定的复发率，无一单独有效的治疗方案［1，2］。研究发现，放疗在瘢痕疙瘩治疗中占有很重要的地位，手术切除后放疗是目前最有效的治疗方案，复发率一般在20%左右，而复发率和电离辐射的总剂量显著相关［3-8］。然而潜在的机制尚不完全清楚。因此，本研究目的在于阐明电离辐射治疗瘢痕疙瘩的相关机制，为预防瘢痕疙瘩早期复发提供思路。

1　材料和方法

1.1标本来源 本研究经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准。标本取自整形美容外科和皮肤科手术患者，并征得患者书面同意。入选标准：经临床和病理确诊瘢痕疙瘩患者，病程超过1年，皮损超过伤口范围，呈浸润持续生长，有发红、痒、痛等临床症状；未经手术、激光、冷冻、糖皮质激素皮损内注射等治疗。排除标准：正常瘢痕、增生性瘢痕、年龄大于60岁的患者。正常人标本取自美容手术无相应疾病患者。

1.2 瘢痕疙瘩患者皮损及正常皮肤原代成纤维细胞的分离、培养和鉴定 采用原代分散细胞培养法，具体步骤如下：局麻下切取瘢痕疙瘩皮损组织或正常皮肤标本，去除皮下脂肪组织，置中性蛋白酶（Dispase II 2 U/mL，德国罗氏试剂）、胶原酶（200 U/L）（美国Sigma公司）溶液中，37℃水浴4 h，分离表真皮；将分离的真皮剪碎，放入胶原酶（200 U/L）溶液中，37℃水浴3 h，消化分散成纤维细胞；收集消化分散的成纤维细胞液，加一定量的完全培养液，200目筛网过滤，收集过滤的细胞悬液，低速离心；洗后细胞种植于50 mL培养瓶，加入含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的DMEM培养基（美国Gibco公司），置37℃，5%CO2培养箱中进行原代培养；每2～3天换液1次，待梭形的成纤维细胞布满瓶底时，以0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液消化细胞并传代增殖。以下所有实验选用第4～7代细胞。原代成纤维细胞采用免疫荧光鉴定，4%多聚甲醛固定，加0.3%Tritonx-100破细胞膜，血清封闭，加入鼠抗人波形蛋白（vimentin，美国Abcam公司）一抗孵育2 h，PBS洗涤后加入羊抗鼠荧光二抗孵育1 h，最后再进行DAPI复染核，荧光显微镜观察，阴性对照不加一抗。

1.3照射条件 于室温下以6MV X射线照射，剂量率为3 Gy/min；照射源至标本距离100 cm，剂量为0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy及8 Gy。

1.4瘢痕疙瘩成纤维细胞照射前后增殖和细胞毒性检测 CCK-8法检测成纤维细胞增殖情况，调整细胞悬液浓度，96孔每孔接种5×103个细胞，5%CO2、37℃孵育，每孔加入10 μL CCK-8溶液（美国Dojindo分子技术公司），继续培养4 h。在酶联免疫检测仪OD450 nm处测量各孔的吸光值。收集照射前后贴壁和漂浮的细胞，台盼蓝染色，计数板计算活细胞率。

1.5瘢痕疙瘩成纤维细胞照射前后细胞周期分布检测 取对数生长期的细胞，经相应处理后，0.25%胰酶消化细胞，加培养基终止消化，混匀，收集到15 mL离心管中。离心去上清液，加入-20℃无水乙醇3 mL，快速震荡混匀，冰盒储存送检，加 100 μg/mL RNA酶，50 μg/mL PI，37℃孵育0.5 h，上机检测。

1.6电离辐射对KFb胶原合成的影响 成纤维细胞制备细胞悬液，按4×104/孔密度接种24孔板。培养板放入CO2培养箱，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养72 h。培养72 h后，从每个孔各吸取1 mL培养基上清液，按羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书方法测定培养基上清液中羟脯氨酸含量，计算每株细胞照射后不同时间测得的胶原浓度，结果以均数±标准差表示。

1.7统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行显著性检验，两组间比较采用最小显著差法（LSD），P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1入选患者及正常人一般情况 本项研究中瘢痕疙瘩患者12例，其中男6例，女6例；年龄12～49岁，平均（34.78±9.83）岁；病程16～110个月，平均发病时间（35.68±12.72）个月；瘢痕疙瘩主要分布在前胸、肩背、颈项、耳廓部等。对照组入选12例，其中男5例，女7例；年龄18～42岁，平均（38.09±6.34）岁。患者组与对照组在性别及年龄构成比差异无显著性（P＞0.05）。

2.2原代成纤维细胞的分离、培养和鉴定 消化分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖，约2周左右原代细胞铺满瓶底，即传代，传代比例1∶3，传代后细胞形态较清楚，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状，漩涡状生长，3天后长满。免疫荧光染色显示：培养的细胞核呈蓝色，卵圆形，胞质呈绿色红色荧光，Vimentin表达阳性。

2.3细胞增生、细胞存活和细胞周期检测 将同样数量的KFb和NFb分别种入96孔板中，分别在24 h、48 h、72 h和96 h测定细胞增殖能力。电离辐射明显抑制KFb的增殖，存在剂量和时间依赖模式，4Gy X-Rays 72 h对KFb的细胞增殖抑制率为47.88%± 1.82%。我们还利用光镜观察法和台盼蓝染色法分别观察了电离辐射对KFb细胞的作用。电离辐射后KFb细胞的形态发生了明显的变化，如细胞核增大，扁平，细胞间隙增大（图1）。台盼蓝染色结果也显示，电离辐射能明显地抑制KFb细胞的活力。此外，我们采用PI染色观察了电离辐射后KFb细胞周期的分布变化，照射后G0/G1比例逐渐增高，出现G1期阻滞（图2）。

2.4KFb细胞4Gy X-Rays辐照后72 h胶原表达采用羟脯氨酸检测试剂盒测定KFb细胞培养上清液中羟脯氨酸含量，辐照后72 h与未辐照对照组胶原浓度分别是（11.749±0.9428）μg/mL和（18.689± 0.8484）μg/mL（P＜0.05）。

图1　1a：电离辐射对NFb细胞形态的影响；1b：电离辐射对KFb细胞形态的影响；1c：电离辐射对NFb细胞活力的影响；1d：电离辐射对KFb细胞活力的影响

图2　4 Gy照射KFb细胞后，随时间延长G0/G1期比例逐渐增高，出现G1期阻滞，而G2/M期比例逐渐降低

3　讨论

瘢痕疙瘩（keloid，K）因其所具备的持续性生长、无自限性、切除后易复发和向正常皮肤侵袭生长的临床特点，目前作为一种肿瘤而进行研究。1，2瘢痕疙瘩组织由细胞成分和细胞外基质成分（ECM）构成。细胞成分对瘢痕疙瘩的生物学行为起决定作用。瘢痕组织内最主要的功能细胞-成纤维细胞的异常增殖、分泌过多细胞外基质的特征性生物学行为，可能是瘢痕疙瘩形成过程中的重要因素，KFb不受正常细胞周期控制时，增殖将超过凋亡［1，7-9］。

在我们的系列研究中，KFb和正常人皮肤成纤维细胞（NFb）来自年龄和性别相匹配的不同个体。前期研究提示两种细胞在形态学方面没有显著区别，但在细胞增殖和胶原产生检测中发现，随着培养时间延长，KFb细胞增殖能力强于NFb细胞，有更多的I型胶原产生，这些结果与既往研究相似［1，2，12，14］。瘢痕疙瘩是创伤修复过程中结缔组织异常增生的结果。前期研究表明KFb在细胞增殖及DNA合成代谢等多个方面，均明显高于健康人皮肤成纤维细胞NFb，细胞周期检测表明KFb存在G2/M期阻滞［12，9］。

为进一步探讨电离辐射抑制瘢痕疙瘩皮损复发的机制，通过原代细胞培养，我们检测了不同剂量X线照射KFb后不同时间的细胞学效应。电离辐射能抑制KFb细胞增殖，同时抑制胶原的产生，诱导KFb细胞出现G0/G1期阻滞。电离辐射对瘢痕疙瘩患者的疗效归因于对瘢痕疙瘩成纤维细胞的损伤作用。细胞核DNA是电离辐射的目标靶位，DNA损伤致使细胞周期停止、凋亡、衰老或其他细胞学改变，不同剂量或作用后的不同时期，其细胞学表现可能不尽相同［4-12］。一些文献报道电离辐射能够诱导DNA甲基化模式发生改变，但对特定基因启动子区CpG岛甲基化状态的影响及通过何种途径作用，目前尚不清楚。而我们之前的研究已经表明瘢痕疙瘩皮损及其成纤维细胞p16基因低表达，其启动区CpG岛中存在甲基化现象［13，14］，电离辐射是否通过诱导其甲基化模式的改变来发挥作用，还需进一步验证。

总之，基于我们的细胞学体外实验研究证据，认为电离辐射能够控制KFb细胞增殖，抑制细胞周期进程，抑制胶原合成，可能是电离辐射抑制瘢痕疙瘩复发的效应机制。

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（收稿：2015-05-19 修回：2015-06-26）

Effects of ionizing radiation on the proliferation of keloid fibroblasts

WANG Li1，ZHANG Liyuan2，JI Shengjun3，JI Jiang2，LENG Hong2，SU Yuhua2.
1.Xietang People's Hospital No.1 Lotus Community Medical Service，Suzhou Industrial Park，Suzhou，215004；2.Second Hospital Affiliated to Soochow University，Suzhou 215004，China；3.Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Suzhou 215002，China Corresponding author：JI Jiang，E-mail：jijiang2222@126.com

Objective：To determine the effects of ionizing radiation on the proliferation of keloid fibroblasts（KFb）.Methods：The cllular morphology，viability，proliferation and cell cycle of KFb before and after ionizing radiation were detected by MTT and flow cytometry.The change of the collagen level before and after treatment was measured by detecting the level of the hydroxyproline in the supernatant of the co-culture. Results：The proliferation inhibition rate of KFb after 4Gy irradiation for 72 hours was（47.88±1.82）%which was higher than that of normal skin fibroblast（39.86±0.07）%，（P＜0.05）.The cellular morphology of KFb was abnormal.The level of hydroxyproline was（11.749±0.9428）μg/mL and（18.689±0.8484）μg/mL before and after irradiation for 72 hours respectively（P＜0.05）.Conclusion：Ionizing radiation inhibits the proliferation of KFb and the generation of collagen.

ionizing irradiation；keloid fibroblast；collagen

国家自然基金项目（编号：81472804；81402517）江苏省自然青年基金项目（编号：BK20130277）

1苏州工业园区斜塘人民医院莲花第一社区卫生服务站，215000

2苏州大学附属第二医院，苏州，215004

3南京医科大学附属苏州医院，215002

季江，E-mail：jijiang2222@126.com