51例新疆寻常型银屑病患者皮损中FOXP1和hMSH2的表达

陈春丽　王慧琴　刘新梅康晓静　吴卫东

51例新疆寻常型银屑病患者皮损中FOXP1和hMSH2的表达

陈春丽1王慧琴2#刘新梅1康晓静1吴卫东2

目的： 检测新疆寻常型银屑病（PV）患者皮损中FOXP1和hMSH2的表达。方法： EnVision免疫组化法分别检测51例新疆PV患者皮损及29例正常人皮肤组织中FOXP1和hMSH2的表达。结果： FOXP1和hMSH2在PV皮损中的阳性表达率（92.16%，94.12%）均高于正常人皮肤组织（65.52%，55.17%），差异有明显统计学意义（P＜0.01）。结论： FOXP1和hMSH2可能与寻常型银屑病的发病有关。

寻常型银屑病； FOXP1； hMSH2

银屑病是多基因遗传背景下由异常活化的T细胞介导的炎症性过度增殖性自身免疫性疾病，主要和环境、细胞免疫、表观遗传等有关。越来越多的研究证明1MiRNA通过与靶蛋白信使RNA的3'端非翻译区结合调控蛋白质编码基因的表达，从而参与银屑病的发病过程［1］。本课题组前期研究证实MiR-34a和MiR-21在新疆寻常型银屑病（PV）皮损中的表达均高于正常皮肤组织，本实验旨在研究其相应的靶蛋白FOXP1和hMSH2在上述两种组织中的表达。

1　对象和方法

1.1研究对象 51例病例均来自2013年1月至2015年1月新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科就诊的PV患者，其中男23例，女28例，年龄7～76岁，平均（32.98±15.58）岁。29例正常人皮肤组织来自泌尿外科和整形外科手术切除多余的皮肤组织，其中男14例，女15例，年龄5～43岁，平均（21.97±14.32）岁。

1.2实验标本的选择 所有患者均具有典型皮损，并经组织病理确诊。取材前3个月未系统使用过维A酸类、糖皮质激素及免疫调节剂治疗；停止光疗及外用药物治疗至少1个月；不伴有其他免疫性及肿瘤性疾病；女性患者排除妊娠、哺乳及月经期。对照组排除自身免疫性、遗传性疾病，无银屑病家族史。本研究获新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.3主要试剂 兔抗人FOXP1单克隆抗体、鼠抗人hMSH2单克隆抗体、兔通用型二抗试剂盒（PV-6000）、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4实验方法

1.4.1EnVision法染色 4 μL厚切片经二甲苯及梯度酒精浓度脱蜡至水，pH值9.0的EDTA抗原修复液中高压修复，放凉后3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，滴加一抗（FOXP1稀释浓度为1∶200，hMSH2稀释浓度为1∶100），同时用已知表达阳性组织作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，4℃冰箱过夜，复温45 min后滴加DAB显色液2～3 min（根据显微镜下观察适时终止染色），苏木素复染、盐酸酒精分化、脱水、封片。

1.4.2阳性结果判定及标准 POXP1及hMSH2阳性显色主要为表皮细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒，单纯胞浆着色为阴性细胞。由两名副高级职称病理医师进行独立双盲评分。每张病理切片随机选取5个光学显微镜高倍视野（×400），根据着色阳性细胞百分数和着色深度进行半定量分级，结果取平均值：着色阳性细胞占计数细胞数的百分数＜50%为0分、50%～75%为1分、＞75%为2分；未着色为0分，浅黄色为1分，棕色为2分，棕褐色为3分。两者得分的乘积为总评分，评分≥2分者判为阳性。

1.5统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，所得数据采用X2检验和Spearman相关分析，检验水准α=0.01。

图1　1a：FOXP1在寻常型银屑病中为表皮全层表达（EnVision法，×100）；1b：FOXP1在正常皮肤组织中主要为表皮基底层和棘层表达（EnVision法，×100）

2　结果

2.1FOXP1在PV患者皮损和正常皮肤组织中的表达情况 FOXP1在PV组阳性表达率为92.16%（47/ 51），主要在表皮全层中；正常皮肤组阳性表达率为65.52%（19/29），主要在表皮基底层和棘层中，两组经四格表检验，差异有统计学意义（X2=9.087，P＜0.01）见图1。

2.2hMSH2在PV患者皮损和正常皮肤组织中的表达情况 见图2。hMSH2在PV组阳性表达率为94.12%（48/51），主要在表皮全层中；正常皮肤组阳性表达率为55.17% （16/29），主要在表皮基底层和棘层中，两组经四格表检验，差异有统计学意义（X2= 17.525，P＜0.01）。

图2　2a：hMSH2在寻常型银屑病中为表皮全层表达（EnVision法，×100）；2b：hMSH2在正常皮肤组织中主要为表皮基底层和棘层表达（EnVision法，×100）

2.3FOXP1和hMSH2在PV患者皮损中表达的关系

FOXP1表达阳性的47例PV患者中，hMSH2表达阳性44例（93.62%）；FOXP1表达阴性的4例PV患者hMSH2表达全部阳性；FOXP1和hMSH2的一致表达率为86.27%。两者经Spearman相关分析，FOXP1 和hMSH2在PV中的表达无相关性（r=-0.073，P= 0.611）。

3　讨论

叉头框蛋白（Forkhead box，FOX）是一类以具有叉头螺旋结构为特征、进化保守的转录因子家族，具有细胞周期调控、机体老化和免疫调节等作用［2］。目前将FOX蛋白分为17类，分别命名为FOXA～Q。FOXP1对免疫系统的细胞发育和功能具有重要调控作用，在免疫系统疾病中发挥重要作用［3］。FOXP1与调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的发育及生物学功能发挥具有密切关系，FOXP1缺失的Treg细胞可抑制CD4+T细胞产生 IFN-γ［4］，而在银屑病皮损中CD4+CD25+Treg细胞的数量较自身未受累皮肤及正常皮肤显著增多，且与疾病的严重程度呈正相关［5］。Zhao等研究发现叉头框转录因子家族的另一转录因子FOXP3受MiR-210的靶向调节可以诱发免疫功能紊乱，从而参与寻常型银屑病的发生发展［6］，而分子生物学研究表明FOXP3可与FOXP1通过亮氨酸拉链结构域相互作用，两者在疾病的发生中可能起协同作用。此外，FOXP1在皮肤基底细胞癌中的阳性表达率显著高于癌旁正常皮肤组织［7］，而银屑病皮损中的角质形成细胞细胞周期比正常细胞缩短，这与肿瘤的发生有着异曲同工之处。黄莉宁等［8］通过Western blot法检测出FOXO1的磷酸化水平在寻常型银屑病皮损中增高，导致下游效应分子的表达异常，使得角质形成细胞出现过度增殖。由以上证据推测，FOXP1也可能参与了寻常型银屑病的发病机制。

DNA错配修复基因（mismatch repair gene，MMR）的功能主要是消除DNA复制过程中由于DNA聚合酶滑动而引起的插入-缺失环的形成和碱基-碱基错配，从而对DNA复制、重组过程中发生的错误进行监测、校正和修复。人mut S同种组蛋白2（human mut S homolog 2，hMSH2）是第一个被分离的人类MMR基因，它在DNA错配修复过程中起主要作用。研究发现，在多种皮肤肿瘤中如皮肤恶性黑素瘤、Bowen病等均存在错配修复系统的异常［9，10］，启动子甲基化是导致hMSH2错配修复功能缺陷的原因之一［11，12］。在急性淋巴细胞白血病患者的细胞系中，hMSH2过表达可以抑制细胞生长和诱导细胞凋亡［12］。Seifert等利用小干扰RNA技术证明在人类黑素细胞中，hMSH2参与调控由UVB辐射诱导的细胞周期调控和细胞凋亡［13］。还有学者证明只有不成熟的复制活跃的细胞，才需要hMSH2的不断纠错，并且这种作用贯穿于整个细胞周期［14］。本实验中hMSH2在银屑病中过表达，可能是由于银屑病皮损中角质形成细胞过度增生和异常分化，导致碱基错配不断增加，细胞修复系统被激活，出现hMSH2代偿性增高。

越来越多的研究证实miRNA的异常表达在银屑病的发病机制中起重要作用。课题组前期通过实时荧光定量PCR实验证实MiR-34a和MiR-21在新疆寻常型银屑病皮损中的表达均高于正常皮肤组织，又通过miRwalk靶基因预测软件（预测网址为 www. umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk）得出MiR-34a和MiR-21的靶基因之一分别是FOXP1和hMSH2。本研究中通过免疫组化法得出FOXP1和hMSH2在新疆PV皮损中的阳性表达率均高于正常皮肤组织，两组差异具有明显统计学意义（X2=9.087，17.525，均P＜0.01），提示MiR-34a和MiR-21通过调控各自靶基因FOXP1和hMSH2在银屑病的发病中发挥作用，其机制可能为MiR-34a的过度表达靶向上调FOXP1，导致银屑病中Treg细胞增多、炎性细胞因子IFN-γ等分泌增加，从而形成银屑病特征性炎性皮损；或hMSH2受MiR-21靶向调控后致启动子区高甲基化，使hMSH2错配修复功能紊乱，从而导致银屑病中角质形成细胞的增殖异常，异常分化的角质形成细胞又反过来激活hMSH2的功能，形成恶性循环。本研究还发现，FOXP1和hMSH2在新疆PV患者皮损中的表达无相关性（r=-0.73，P＞0.01），表明FOXP1和hMSH2在促进银屑病发生发展中的作用可能是独立的。但以上实验结论需大样本进一步验证，FOXP1和hMSH2在银屑病的发病过程中还有哪些途径也尚需进一步研究。

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（收稿：2015-06-28 修回：2015-07-26）

Expression of FOXP1 and hMSH2 in patients with psoriasis vulgaris in Xinjiang region

CHEN Chunli1，WANG Huiqin2，LIU Xinmei1，KANG Xiaojing1，WU Weidong2.
1.Department of Dermatology and Venereology，People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China；2.The Center of Clinical Research，People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China Corresponding author：WU Weidong，E-mail：xjwudong@126.com

Objective：To detect the expression level of FOXP1 and hMSH2 in the lesions of patients with psoriasis vulgaris in Xinjiang region.Methods：The level of FOXP1 and hMSH2 was detected by EnVision immunohistochemistry method in the lesions of 51 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 29 healthy controls.Results：The level of FOXP1 and hMSH2 in lesions was 92.16%and 94.12%which was higher than those in the normal skin（65.52%and 55.17%），with significant differences（P＜0.01）.Conclusion：FOXP1 and hMSH2 may be associated with the onset of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FOXP1；hMSH2

新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2015211C201）

1新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科，乌鲁木齐，830001

2新疆维吾尔自治区人民医院临床医学研究中心，乌鲁木齐，830001

吴卫东，E-mail：xjwudong@126.com#并列第一作者