丹参川芎嗪对博来霉素诱导大鼠肺间质病变的影响

宋远圆　殷寒秋　殷松楼

摘要：目的 观察丹参川芎嗪对博来霉素所致间质性肺病大鼠肺组织病理变化及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及核转录因子-κB（NF-κB）表达的影响。方法 45只SD雄性成年大鼠随机分为对照组模型组和丹参川芎嗪治疗组（治疗组），每组15只。模型组、治疗组经气管一次性滴注博来霉素（5mg/kg）0.2ml～0.3ml复制间质性肺病大鼠模型；对照组经气管滴注同体积生理盐水；造模后第1 d起，治疗组每日经腹腔注射丹参川芎嗪2ml/kg，对照组及模型组每日经腹腔注射同等体积生理盐水。于第28 d处死各组大鼠，取肺组织行苏木素-伊红（HE）染色和Masson染色观察肺脏组织病理变化；免疫组织化学法检测肺组织TNF-α、NF-κB的表达；碱样本水解法测定肺组织中羟脯氨酸含量。结果 ①对照组未见明显炎症、胶原沉积及纤维化改变；模型组可见明显肺泡炎症、胶原沉积、纤维化改变，TNF-α、NF-κB表达明显增高；②治疗组肺泡炎和肺纤维化程度均较模型组轻，差异有统计学意义（P<0.05）；③治疗组肺组织中TNF-α、NF-κB的表达较模型组减少，差异有统计学意义（P<0.05）；④治疗组羟脯氨酸（hydroxyproline）含量较模型组减少（P<0.05）。结论 TNF-α、NF-κB在模型组大鼠肺组织中水平明显降低，提示丹参川芎嗪改善大鼠肺间质性病变可能与抑制肺组织TNF-α、NF-κB表达、抑制胶原沉积有关。

关键词：丹参川芎嗪；肺间质疾病；博来霉素；TNF-α、NF-κB；羟脯氨酸

间质性肺病（interstitial lung disease，ILD）是一组主要累及肺间质、肺泡及细支气管的肺部弥漫性疾病，病因未明，可以是原发的，也可以继发于多种疾病、某些药物及石棉、粉尘等，其中结缔组织病是继发性间质性肺病最常见病因。ILD病变进展快，死亡率高，其共同的病理特征为不同程度的炎症及纤维化表现，最终可进展为肺纤维化（pulmonary fibrosis），该病目前缺乏有效的治疗手段，主要治疗药物糖皮质激素及免疫抑制剂，不良反应多且部分患者对治疗反应差，随病情迁延，可出现呼吸衰竭、严重感染、心血管疾病等，是患者死亡的重要原因。在ILD发病机制研究中，多种细胞因子参与的细胞网络是研究的热点。TNF-α作为一种前炎症细胞因子，在细胞因子网络中调节刺激其他细胞因子共同介导肺泡炎，在肺泡炎进展为肺纤维化过程中发挥重要作用[1]。NF-κB家族是具有多向转录激活功能的蛋白，存在于多种细胞中，其激活后可使细胞合成并释放大量炎性介质，进而刺激成纤维细胞产生胶原纤维[2]。近年研究发现丹参、川芎嗪在抗炎、抗纤维化方面有重要作用[3]。本研究观察丹参川芎嗪对博来霉素诱导间质性肺病大鼠肺组织病理变化的影响，探讨丹参川芎嗪ILD发生中的治疗作用及可能机制。

1资料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与药物 雄性SD大鼠45只，体质量200～230g，由徐州医学院动物中心提供。平阳霉素（BLM-A5，天津太河药业有限公司），丹参川芎嗪注射液（贵州拜特制药有限公司）。

1.1.2实验试剂 兔抗鼠TNF-α多克隆一抗抗体，兔抗鼠NF-κB多克隆一抗抗体，羊抗兔SP试剂盒，浓缩型DAB试剂盒（均购自北京博奥森生物技术有限公司），羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所），Masson染色试剂盒（南京凯基生物工科技公司）。

1.1.3实验器材 Multiskan Spectrum全波长酶标仪（Thermo Scientific公司），普通光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2实验方法

1.2.1动物分组与造模 将45只SD雄性成年大鼠在实验条件下饲养一周，随机分为3组：对照组、模型组和治疗组，每组15只。参照文献[4-5]进行造模。模型组、治疗组用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定于置于手术平板上，将手术平板置于45度倾斜，采用口-气管插管法，将16 G腰穿针经口-声门插入气管，连接1 ml注射器，缓慢注入博来霉素生理盐水溶液（5 mg/kg）约0.2 ml～0.3 ml，继续注入0.3 ml的空气，注后立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。

1.2.2药物干预 对照组大鼠同样方法注入等体积的生理盐水。造模后对照组和模型组每日予生理盐水约2 ml/kg腹腔注射，治疗组每日经腹腔注射丹参川芎嗪注射液（2 ml/kg）。各组分别于气管内注药后第28 d各处死大鼠。

1.2.3肺组织标本收集 将大鼠称重后，以10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠手术板上，经腹主动脉放血法处死大鼠。取左肺组织放于4%多聚甲醛溶液固定。随机在不同部位取材3块，石蜡包埋，制作成3 μm厚的切片。同时收取右肺组织-80℃保存，测羟脯氨酸含量。

1.3指标检测

1.3.1免疫组织化学检测 TNF-α、NF-κB的表达一抗分别为兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、NF-κB多克隆抗体，稀释度为1：200，二抗为HRP标记羊抗兔IgG，按免疫组织化学试剂盒说明书进行操作。采用计算机病理图像分析系统在高倍镜视野（×400）下随机取10个视野，测量细胞中阳性颗粒的平均光密度（OD），计算各平均值。

1.3.2肺组织羟脯氨酸含量测定 准确称量肺组织标本100mg，采用碱水解法检测各组大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量，具体操作严格按试剂盒说明书进行。

1.3.3肺组织病理学检查 光学显微镜下观察肺泡炎和肺纤维化，随机选择10个视野，根据Szapiel等[6]方法确定。肺泡炎分为4级：无肺泡肺炎0分；轻度肺泡肺炎1分；中度肺泡肺炎2分；重度肺泡肺炎3分。肺间质纤维化分级标准：无纤维化0分；轻度肺纤维化1分；中度肺纖维化2分；重度肺纤维化3分。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料进行正态性检验，采用均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。以α=0.05为检验水准，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠一般行为改变 对照组大鼠体重增加，喜活动，毛发光泽。模型组和治疗组大鼠在造模后出现活动减少，精神差，饮食及饮水减少，毛发无光泽，体重下降，并出现呼吸急促、咳嗽及挠鼻等呼吸系症状，其中模型组大鼠上述表现最明显，治疗组大鼠一般状况较B组好，体重下降不明显，7 d后饮食及饮水较前增加，体重有所上升。

2.2大鼠肺组织形病理情况 模型组大鼠肺组织HE染色可见第28天肺泡结构破坏，支气管壁及其周围，血管周围及肺间质可见胶原形成、纤维化，见图1；Masson染色可见明显的蓝色胶原纤维。治疗组肺泡炎及纤维化程度均较模型组减轻，见图2。

图1 各组大鼠肺组织病理改变（苏木精-伊红染色，×200）

注：A、B、C分别代表对照组、模型组、治疗组。

图2 各组大鼠肺组织病理改变（苏木精-伊红染色，×200）

注：A、B、C分别代表对照组、模型组、治疗组。

3组动物肺组织炎症评分的比较对照组无明显炎症反应，治疗组炎症反应较对照组重，但较模型组明显减轻（P<0.05），见表1。

3组动物肺组织纤维化评分的比较对照组无明显纤维化；治疗组纤维化程度较对照组较重（P<0.05），但较模型组明显减轻（P<0.05），见表1。

2.3免疫组化检测各组大鼠肺组织TNF-α表达 肺组织中TNF-α主要在胞质表达，并主要分布于支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、肺泡I型上皮细胞和肺成纤维细胞。模型组肺组织TNF-α的表达较对照组高，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组肺组织TNF-α的表达高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），但低于模型组（P<0.05），见表2，图3。

图3 各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化染色（×200）

注：A、B、C分别代表对照组、模型组、治疗组。

2.4免疫组化检测各组大鼠肺组织NF-κB表达 NF-κB主要在胞核表达，模型组大鼠肺组织NF-κB较对照组及治疗组表达明显，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组肺组织NF-κB的表达高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），但低于模型组（P<0.05），见表2，图4。

图4 各组大鼠肺组织NF-κB免疫组化染色（×200）

注：A、B、C分别代表对照组、模型组、治疗组。

2.5肺组织羟脯氨酸含量与对照组比较 模型组及治疗组肺组织羟脯氨酸含量较对照组均明显增加（P<0.05）；与模型组相比，治疗组大鼠肺组织羟脯氨酸含量明显降低（P<0.05），见表3。

3讨论

ILD常由早期的肺泡炎进展到肺纤维化，病死率高，早期诊断和治疗是阻断ILD进展的关键[7]。ILD确切的发病机制及病因尚未完全明确，其中对于细胞因子在ILD发生发展过程中的作用研究较为深入。近年来表明TNF-α在ILD患者及动物模型中均有高表达[8-10]。TNF-α是一种多效性细胞因子，在炎症反应、免疫调节等方面有重要作用。TNF-α可导致炎症、细胞坏死、新血管的形成，并可促进内皮素-1的产生而引起血管壁的损伤。作为重要的前炎症细胞因子，TNF-α可以促进lL-1、IL-2、IL-6、CCL2、PDGF、TGF-β1等细胞因子产生及分泌，触发肺泡上皮细胞的"瀑布式"炎症级联反应，而TGF-β1作为肺纤维化的始动因素，是目前已知最强的促纤维化因子[10]。胡玉洁等[11]观察TNF-α的特异性阻断剂依那西普可直接阻断MAPKs信号通路，同时可通过下调TGF-β1的表达抑制MAPKs的活化从而阻断肺纤维化的进程。本实验中，在模型组大鼠肺组织中早期即可发现TNF-α的表达，在第28 d，模型组大鼠肺组织TNF-α表达仍明显高于对照组及治疗组，肺泡炎及肺纤维化程度较对照组及治疗组重，提示TGF-β1在肺泡炎的发生及由肺泡炎进展为肺纤维化的过程中发挥重要作用。NF-κB是研究较多的核转录因子，其能介导TNF-α触发过度的炎症反应和氧化应激，造成细胞损伤，导致细胞存活率明显降低[12]。本实验中，NF-κB在对照组肺组织中偶有表达，在模型组中，表达明显增多，主要表达于肺间质巨噬细胞及炎症细胞核中，提示肺组织高表达NF-κB与肺组织纤维化形成关系密切。羟脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是胶原蛋白所特有的氨基酸，通过对肺组织中羟脯氨酸含量的测定，可以了解其胶原蛋白分解代谢状况，因此测定HYP的含量常被用于肺纤维化的研究。本实验Hyp含量测定表明，对照组相比，模型组及治疗组肺组织中Hyp含量增高，而治疗组中Hyp含量低于同时期模型组，提示丹参川芎嗪能调节肺组织中胶原代谢，减轻肺组织胶原沉积，从而起到减轻肺纤维化的作用。

近年来，丹参联合川芎治疗肝纤维化、肺纤维化、肾脏纤维化及心肌纤维化等方面均有报道。丹参的主要功效为祛瘀止痛，活血通经，丹参能显著抑制白细胞聚集，减少肺内活性物质的产生，从而减轻肺损伤。有研究表明丹参可抑制NF-κB的活化，減少细胞因子炎症介质的合成与释放，减少成纤维细胞的活化[13]。丹参可以增加Fas及Bax的表达并降低Bcl-2的表达，促使成纤维细胞凋亡[14]，而起到抗肺纤维化的作用。川芎嗪可直接清除具有细胞毒性作用的自由基，抗脂质过氧化，具有改善微循环、扩张小动脉、拮抗钙离子的作用，能抑制成纤维细胞分裂、增殖，从而起到抗组织损伤和防治肺纤维化作。川芎嗪可通过作用于TGF-β1/Smad信号转导途径，下调TGF-β1和Smad2/3的表达发挥抗纤维化的作用[15]。在高糖所致的慢性腹膜炎大鼠模型中，川芎嗪可拮抗大鼠腹膜间皮细胞MCP-1和NF-κBp65的表达，减轻腹膜慢性炎症，延缓腹膜纤维化的发生。丹参与川芎嗪既有相似的药理作用，又有各自不同的作用靶点，两者联合应用可减少单药用药剂量，降低毒副作用。本实验中，我们经气管一次性滴注博来霉素复制间质性肺病大鼠模型，发现随着时间变化，模型组大鼠肺组织病理显示从肺泡炎逐渐变为肺间质纤维化，说明间质性肺病动物模型复制成功。实验结果显示，与模型组相比较，治疗组TNF-α、NF-κB表达明显减少，Hyp含量减低，结合病理学变化，提示腹腔注射丹参川芎嗪合剂能明显改善博来霉素所致的肺泡炎，减轻炎症浸润，抑制TNF-α、NF-κB合成和分泌，抑制胶原沉积，从而减少成纤维细胞的增殖与活化，改善肺间质性病变的预后。

总之，丹参联合川芎嗪能减轻肺纤维化程度，其机制可能通过抑制TNF-α及NF-κB的表达，减轻炎症反应，对肺纤维化的发生有一定预防作用。

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编辑/申磊