液相色谱法测定注射用盐酸博来霉素组分

陆常辉，桂王艳

（1.瀚晖制药有限公司，浙江 杭州 310020；2.浙江海正药业股份有限公司药品研发QC，浙江 杭州 311404）

博来霉素为发酵来源的糖肽类抗肿瘤抗生素类药物，适用于皮肤癌、头颈部癌（上颌窦癌、咽部癌、唇癌等）、肺癌（特别是原发和转移性磷癌）、食道癌等的治疗[1]。博来霉素为多组分药物，因此组分是药品质量控制中重要的项目之一。本文参考相关文献，建立了比各药典标准更优的博来霉素组分检查方法。方法经验证，专属性、线性、精密度和准确度等均符合要求，可保证组分检查结果的准确性。

1 仪器与试药

岛津LC-20AD高效液相色谱仪，软件LabSolutions色谱工作站；安捷伦1269高效液相色谱仪，软件OpenLab色谱工作站；S220型pH计（METTLER TOLEDO公司），XP26型电子分析天平（METTLER TOLEDO公司）。

注射用盐酸博来霉素（浙江海正药业股份有限公司，批号20BH03010、20BH03011、20BH03012）；甲醇和乙腈均为色谱纯，己烷磺酸钠为高效液相色谱专用试剂，乙二胺四乙酸二钠和氨水为分析纯，水为纯化水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18（4.6mm×150mm，3.5µm）；以己烷磺酸钠溶液（取己烷磺酸钠4.7g与乙二胺四醋酸二钠1.86g，加0.08mol/L醋酸溶液使溶解并稀释至1000ml，用氨溶液调节pH值至4.3）为流动相A；甲醇:乙腈（70:30）为流动相B；按表1线性梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为254nm；进样量10µl。

表1 梯度洗脱程序

2.2 系统适用性

取本品适量，加水制成每1ml约含2500博来霉素单位的溶液，量取10µl注入液相色谱仪，按表1进行梯度洗脱。色谱图中两个主组分峰与各自相邻杂质峰的分离度不小于1.0；理论塔板数按博来霉素A2峰计算，应不低于8000。

2.3 组分测定

取本品，加水制成每1ml约含2500博来霉素单位的溶液，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；按峰面积归一化法计算博来霉素A2，博来霉素B2，博来霉素B4，去甲基博来霉素A2，去甲基博来霉素A2外其他杂质之和。

3 方法学研究

3.1 专属性考察

分别在1.10W/m2强光，0.5N盐酸溶液，0.01N氢氧化钠溶液，5%过氧化氢溶液，以及在40℃、75%RH条件下对样品进行降解。进样测试。

降解幅度最大的热降解条件下样品色谱图见图1，在拟定的色谱条件下，博来霉素的各组分及杂质均能有效分离，方法专属性良好。

图1 热降解样品溶液典型图谱

3.2 检测限和定量限

此色谱条件下，博来霉素的检测限为0.222 μg/ml，定量限为0.739 μg/ml；去甲基博来霉素A2的检测限为0.242 μg/ml，定量限为0.805 μg/ml；博来霉素B4的检测限为0.227 μg/ml，定量限为0.757 μg/ml。

3.3 线性

配制线性梯度溶液，进样检测，博来霉素A2+博来霉素B2在定量限至2mg/ml范围内呈良好线性，线性方程为y=4.9444x-2.7221（R2=1.0000）；去甲基博来霉素A2在0.8 μg/ml～128 μg/ml内呈良好线性，线性方程为y=4.5821x-0.8333（R2=1.0000）；博来霉素B4在0.75 μg/ml～30 μg/ml呈良好线性，线性方程为y=3.2560x-0.1221（R2=1.0000）。

3.4 准确度

将已知量的组分加入博来霉素中，再按面积归一化法测定各自的量并计算回收率。结果表明在8.051μg/ml～120.770μg/ml的加样范围内，去甲基博来霉素A2的回收率范围为92.5%～96.1%；在0.750μg/ml～30.019μg/ml的加样范围内，去博来霉素B4的回收率范围为96.4%～103.4%；在8.051μg/ml～120.770μg/ml的加样范围内，去甲基博来霉素A2的回收率范围为92.5%～96.1%；

3.5 精密度

重复性：配制6份加入杂质的供试品溶液，测定组分及杂质。结果显示6份样品溶液中博来霉素A2、博来霉素B2和博来霉素A2+博来霉素B2的RSD小于0.1%，其他总杂质的RSD小于3.2%，重复性符合要求；

中间精密度：在不同HPLC系统、不同批次的色谱柱，不同实验人员及不同日期检测重复性同批次样品。并将结果于与重复性实验对比，博来霉素A2、博来霉素B2及两者的加和的差值在0.1%～0.2%之间。去甲基博来霉素A2、博来霉素B4，及除以上杂质外的其他杂质的和的差值不超过0.06%。证明方法具有良好的中间精密度。

4 组分测定结果

采用以上方法测定海正药业的三批注射用盐酸博来霉素，博来霉素A2与博来霉素B2的和分别为95%、96%、95%；博来霉素B4均小于1%；去甲基博来霉素A2分别为1.0%、0.9%和1.2%；去甲基博来霉素A2外其他杂质之和分别为3.6%、3.4%、3.7%。

5 讨 论

对比本方法与现行版美国药典[2]、英国药典[3]和日本药典[4]收载的博来霉素相关组分方法，本方法能检测出更多的杂质，有利于产品的质量控制。对比结果详见表2。

表2 不同方法组分检测结果对比