DYX1C1基因rs3743205位点等位基因的功能研究

王志超，沈黎，刘得水，李丹，吴桐2，，赵阿勐，崔光成.齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔　6006；2.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔　6006

DYX1C1基因rs3743205位点等位基因的功能研究

王志超1，沈黎1，刘得水1，李丹1，吴桐2，1，赵阿勐1，崔光成1
1.齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔161006

目的为鉴定儿童发展性阅读障碍发病相关易感基因DYX1C1的rs3743205位点-3C/T不同等位基因对基因调控区转录活性的影响。方法本研究构建含DYX1C1基因rs3743205位点-3C/T不同等位基因的萤光素酶报告基因重组质粒，体外转染原代培养神经细胞并测定其瞬时表达萤光素酶活性。结果体外转染增殖期原代培养神经细胞，含等位基因-3T重组质粒的报告基因荧光素酶表达活性高于含等位基因-3C重组质粒，并均低于PGL3-control Plasmid。结论位于DYX1C1基因5'调控区的rs3743205位点-3T等位基因可能参与基因的转录调控，-3C等位基因可能是儿童发展性阅读障碍的易感基因。

儿童发展性阅读障碍；DYX1C1基因；rs3743205位点；转录活性

［Abstract］Objective To identify the effect of children developmental dyslexia invasion susceptibility gene DYX1C1 rs3743205 site-3C/T different gene alleles on transcription activity in gene control region.Methods The luciferase reporter gene recombinant plasmid containing DYX1C1 gene rs3743205 site-3C/T different gene alleles was structured，and the nerve cells were primarily cultured transfection in vitro and the transcient expression of luciferase activity was measured. Results The nerve cells were primarily cultured in transfection in vitro multiplication period，the expression activity of luciferase containing gene alleles-3T recombinant plasmid reporter gene is higher than that of the recombinant plasmid containing gene alleles-3C，and both were lower than that of PGL3-control plasmid.Conclusion The rs3743205 site-3T gene alleles in the gene alleles gene 5'control region may participate in the gene transcriptional control，and-3C gene alleles may be the susceptibility genes of children developmental dyslexia.

［Key words］Children developmental dyslexia；DYX1C1 gene；Rs3743205 site；Transcription activity

发展性阅读障碍（Developmental Dyslexia）是在儿童学龄期普遍出现的一种学习障碍，部分儿童虽然拥有正常智力、情感以及相应的教育及社会文化机会，但在阅读方面会出现特殊学习困难状态［1］。儿童发展性阅读障碍是一种神经认知缺陷，家族聚集研究以及双生子研究发现语言障碍具有明显的家族聚集性［2］。儿童发展性阅读障碍的全基因组关联研究发现DYX1C1基因的rs3743205位点的基因多态与发展性阅读障碍相关［3］，但是DYX1C1基因多态性的对神经系统的功能影响尚不清楚。为进一步证实和解释其遗传关联分析的结果，本课题以期通过体外转染原代培养神经细胞含DYX1C1基因rs3743205位点不同等位基因的萤光素酶报告基因重组质粒并测定其瞬时表达萤光素酶活性，探讨位于DYX1C1基因5'调控区rs3743205位点-3C/T等位基因对报告基因转录活性的影响。

1　材料与仪器

1.1实验动物

SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠，购买于哈尔滨医科大学实验动物医学部。经雌雄合笼获得子代新生24h 的SD乳鼠。

1.2试剂

DMEM/F12培养基（Hyclone公司）；灭活胎牛血清（Hyclone）；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；pGL3-Luciferase reporter vectors（Promega公司），pRL-TK vector（Promega公司），anti-NeuN（Millipore公司）。

1.3仪器

二氧化碳孵箱（Thermo公司）；超净工作台（苏净安泰）；倒置显微镜 （Olympus）；TD-20/20 Luminometer （Turner Design）。

2　方法

2.1原代培养神经细胞及鉴定

新生24 h SD乳鼠，消毒，断颈剥离大脑皮质，冷PBS溶液中剪碎，离心弃上清，胰蛋白酶消化15min，中间震荡两次。加入不含胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，过滤，离心弃上清。重新加入培养基，吹打混匀，置于37℃含5%CO2的培养箱内培养。24 h后吸弃全部种植培养液，换成含神经营养因子的培养液进行培养。接种第3天，在培养皿中加入阿糖胞苷，48 h后更换含神经营养因子的培养液继续培养，以后每3 d半量换液1次，选取对数生长期细胞进行实验。采用免疫荧光标记NeuN，鉴定神经细胞。

2.2分组

按照不同的处理分为阳性对照组 （PGL3-control plasmid）、阴性对照组 （PGL3-Basic plasmid）、DYX1C1基因pGL3-C重组质粒转染组，DYX1C1基因pGL3-T重组质粒转染组，共4组，同时设三组平行对照。

2.3转染

转染前1 d，接种1×105个细胞至24孔板中。细胞密度长至60%～70%融合度时进行转染。用无血清的DMEM培养基稀释重组质粒DNA及内参照质粒pRLTK，轻轻混匀，室温放置。稀释转染工作液，室温放置20～30min。轻轻混匀转染工作液，逐滴加入培养液中，将培养液轻轻混匀，置37℃含5%CO2的培养箱内培养24～48 h后裂解。

2.4转染真核细胞的裂解

按 Dual-Luciferase Reporter Assay System提供的Protocol进行双荧光素酶报告基因的体外表达实验。

2.5测定荧光素酶活性

在TD-20/20Luminometer萤光分析仪上测定。

2.6统计分析

采用SPSS 16.0软件进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐用SNK检验，P＜0.05有统计学意义。

3　结果

3.1原代培养神经细胞

新生大鼠海马细胞种后6～12 h，大部分细胞可贴壁，呈圆形或椭圆形，个别细胞开始伸出1～2个突起。培养3 d后胞体明显增大，呈椎体形，有突起并形成稀疏网络。培养5～7 d后，细胞的突起进一步变长和复杂度增多，并形成相对密集神经网络，免疫荧光标记NeuN鉴定神经细胞（见图1）。

图1　免疫荧光标记NEUN鉴定原代培养神经细

3.2含DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因DNA片段的萤光素酶报告基因活性

萤光素酶报告基因活性结果显示，阳性对照pGL3-control plasmid及含DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因重组质粒的报告基因活性明显高于阴性对照pGL3-basic plasmid（P＜0.05）；含DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因重组质粒的报告基因活性低于阳性对照pGL3-control plasmid（P＜0.05）；含T等位基因的重组质粒的报告基因活性明显高于含C等位基因的重组质粒的活性（P＜0.05）（见图2）。

图2　DYX1C1基因-3C和-3T不同等位基因重组质粒转染增殖期原代培养神经细胞萤光素酶报告基因活性结果（n=6，±s）。

4　讨论

儿童一旦出现发展性阅读障碍，其行为、认知、情感、社会适应等方面都会受到影响，严重阻碍儿童知识的获得和能力的提高，给家庭及社会带来巨大经济负担和精神压力。本课题组前期通过对儿童发展性阅读障碍患者进行全基因组关联研究，结果发现DYX1C1基因的rs3743205位点的基因多态与发展性阅读障碍相关［3］。DYX1C1是首个发现的阅读障碍的易感基因，定位在第15号常染色体短臂 （15q21）［4-5］，DYX1C1基因表达的蛋白质位于大脑皮层的神经元与白质的神经胶质细胞中，子宫内RNA干扰抑制DYX1C1表达的大鼠可发生听力加工与空间学习障碍［6］。DYX1C1基因-3C/T多态性位点位于DYX1C1基因启动子区，而启动子近侧区域包含了控制转录起始的元件，因此该区域的基因多态性可以影响基因的转录功能，从而调节DYX1C1基因的表达［7］。本研究为进一步证实和解释DYX1C1基因rs3743205位点不同等位基因遗传关联分析的结果，通过体外转染细胞含DYX1C1基因rs3743205位点不同等位基因，探究DYX1C1基因rs3743205位点等位基因的功能研究。

为更接近神经系统状态及去除不同细胞混杂因素影响，因此本次实验单独原代培养神经细胞。神经元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）是一种表达在脊椎动物神经系统成熟神经细胞胞核特异性表达的蛋白之一［8］，其免疫反应性阳性提示原代培养的细胞为神经细胞。

荧光素酶报告基因实验结果显示，含TT等位基因的重组质粒的报告基因表达活性明显高于含CC等位基因的重组质粒，差异有统计学意义，提示DYX1C1基因-3C/T位点在原代培养神经细胞中具有调节基因转录活性的作用，-3TT种基因型可能存在较强的启动子功能，并且-3C等位基因可能是儿童发展性阅读障碍的易感基因。

综述所述，本次研究在基因多态性全基因组关联分析的基础上，证实了DYX1C1基因启动子区-3C/T位点的功能。发现TT基因型对DYX1C1基因启动子活性有所增强，但是这种单个核苷酸变异影响转录调控功能的原因尚不清楚，有待今后进一步研究不同等位核酸序列与核蛋白结合的能力。此项研究结果说明了探究儿童发展性阅读障碍的易感基因结构功能，为其易感人群作出早期预防与干预甚至心理行为矫治提供理论依据和实践基础具有相当的社会意义。

［1］Yule W，Rutter M，Berger M，et al.Over-and underachievement in reading：distribution in the general population.The British journal of educational psychology，1974，44 （1）：1-12.

［2］Katusic SK，Colligan RC，Barbaresi WJ，et al.Incidence of reading disability in a population-based birth cohort，1976-1982，Rochester，Minn.Mayo Clinic proceedings，2001，76 （11）：1081-1092.

［3］王志超，崔光成，赵阿勐，等.儿童发展性阅读障碍的全基因组关联研究［J］.卫生研究，2015，44（5）:767-779.

［4］Scerri TS，Fisher SE，Francks C，et al.Putative functional alleles of DYX1C1 are not associated with dyslexia susceptibility in a large sample of sibling pairs from the UK.Journal of medical genetics，2004，41（11）：853-857.

［5］Dahdouh F，Anthoni H，Tapia-Paez I，et al.Further evidence for DYX1C1 as a susceptibility factor for dyslexia.Psychiatric genetics，2009，19（2）：59-63.

［6］Marino C，Citterio A，Giorda R，et al.Association of shortterm memory with a variant within DYX1C1 in developmental dyslexia.Genes，brain，and behavior，2007，6（7）：640-646.

［7］Nopola-Hemmi J，Taipale M，Haltia T，et al.Two translocations of chromosome 15q associated with dyslexia.Journal of medical genetics，2000，37（10）：771-775.

［8］Volkmann N，Marassi FM，Newmeyer DD，et al.The rheostat in the membrane：BCL-2 family proteins and apoptosis.Cell death and differentiation，2014，21（2）：206-215.

Function Research on DYX1C1 Gene rs3743205 Site Gene Alleles

WANG Zhi-chao1，SHEN Li1，LIU De-shui1，LI Dan2，WU Tong1，ZHAO A-meng1，CUI Guang-cheng1
1.Qiqihara Medical College，Qigihar，Heilongjiang Province，161006 China；2.Qiqihara First Hospital，Qigihar，Heilongjiang Province，161006 China

R749.94 R179

A

1672-5654（2016）05（a）-0046-03

［项目编号］黑龙江省教育厅科学技术研究项目 （项目编号: 12541912）。

2016-02-18）