花姜酮对鼻咽癌细胞株放疗敏感性的影响

刘珺，廖剑绚，唐洪波，周芝芳南华大学附属第一医院耳鼻喉科，湖南衡阳　421001

花姜酮对鼻咽癌细胞株放疗敏感性的影响

刘珺，廖剑绚，唐洪波，周芝芳
南华大学附属第一医院耳鼻喉科，湖南衡阳421001

目的观察花姜酮处理对鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的影响。方法体外培养鼻咽癌细胞系CNE-2。并根据不同的实验目的分为对照组、γ-射线干预组以及γ-射线联合花姜酮处理组。其中对照组包括空白对照组和花姜酮处理组，分别给予等体积培养基或0～20μmol/L花姜酮处理48 h，γ-射线组采用剂量率为100cGy的γ-射线照射，联合治疗组细胞采用花姜酮预处理24 h后用γ-射线照射。处理结束后采用MTT法检测CNE-2细胞增殖情况，流式细胞术检测CNE-2细胞周期改变情况。结果 0～20μmol/L花姜酮或100cGy γ-射线单独处理48 h后，对人鼻咽癌CNE-2细胞生长无明显影响；而同时联合不同浓度花姜酮与100cGy的γ-射线处理后，随着花姜酮浓度的增高，细胞增殖水平随之降低。流式细胞术也显示，0～20μmol/L花姜酮联合100cGy γ-射线照射后，可将细胞阻滞在G1期，同时可降低S期、G2/M期细胞的比例。结论花姜酮通过改变CNE-2细胞周期而发挥对细胞放疗增敏作用。

花姜酮；鼻咽癌细胞；放疗；敏感性

［Abstract］Objective To observe the effect of zerumbone treatment on the radiosensitivity of the nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells.Methods nasopharyngeal cancer cell line CNE-2 was cultured in vitro and divided into the control group，gamma ray intervention group and gamma ray combined with zerumbone treatment group，among them，the control group included the blank control group and the zerumbone treatment group，and they were respectively given equal-volume culture media or 0-20μmol/L zerumbone treatment for 48h，the gamma ray group adopted 100cGy gamma ray radiation，the combined treatment group adopted gamma ray radiation after the zerumbone pretreatment for 24h，and the CNE-2 cell proliferation was detected by MTT method and CNE-2 cell cycle changes were detected by flow cytometry at the end of treatment. Results After 48h single treatment，0-20μmol/L zerumbone or 100cGy gamma ray radiation had no obvious effect on the human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cell growth；but the combined treatment of different concentrations of zerumbone and 100cGy gamma ray showed that with the increase of the zerumbone concentration，the cell proliferative level decreased，and the flow cytometry also showed that after the treatment of 0-20μmol/L zerumbone and 100cGy gamma ray radiation，the cells were arrested in G1 phase，at the same time，the cell proportions in S stage and G2/M stage could be reduced.Conclusion Zerumbone plays a sensibilization role in cell radiotherapy by changing the CNE-2 cycle.

［Key words］Zerumbone；Nasopharyngeal cancer cell；Radiotherapy；Sensitivity

鼻咽癌（nasophary ngeal carcinoma，NPC）是我国两广地区最常见的头颈部恶性肿瘤之一，病理学上大部分表现为低分化鳞癌和未分化癌，且具有高转移和高复发性［1］。NPC病因尚未明确，吸烟、EB病毒感染、饮食与居住环境受均与NPC的发病有关［2］。尽管放射治疗可提高NPC的局部控制率，但其应用受到多因素的限制［3］。研究表明，某些中草药提取物对提高肿瘤细胞对放疗的敏感性方面具有协同作用，花姜酮就是其中一种［4-5］。该研究旨在观察花姜酮对鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性的影响。

1　材料与方法

1.1主要实验材料

花姜酮（纯度≥95%）购自Sigma-Adrich；RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清购自美国Life公司，MTT试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，Annexin V-FITC调往检测试剂盒购自Keygen。

1.2细胞培养与处理

CNE-2鼻咽癌细胞株（购自美国ATCC）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃，5%CO2条件下培养。并根据不同的实验目的分为对照组、γ-射线组以及γ-射线联合花姜酮组。其中对照组包括空白对照组和花姜酮处理组，分别给予等体积培养基或0～20μmol/L花姜酮处理48 h，γ-射线组采用剂量率为100 cGy的γ-射线照射，联合治疗组细胞采用花姜酮预处理24 h后用γ-射线照射。联合治疗组细胞采用花姜酮预处理24 h后用γ-射线照射。

1.3细胞活性检测

采用MTT法观察花姜酮对CNE-2细胞的增殖情况，即，生长于96孔板中的CNE-2细胞处理结束后，每孔加入30 μL MTT溶液继续孵育2 h。弃上清，加入200 μL DMSO，漩涡振荡器上充分混匀，用酶标仪测定各孔的吸光度值。

1.4细胞周期分析

CNE-2细胞处理完毕后，按照商家提供的Annexin V-FITC试剂盒分析CNE-2细胞的周期改变情况。即，CNE-2细胞制备成单细胞悬液后，调整其密度为5×105/mL，根据试剂盒提供的步骤加入Annexin-V/FITC和PI后，用BD公司的Callibur型流式细胞仪检测细胞周期改变情况。

1.5统计方法

2　结果

2.1不同浓度花姜酮对CNE-2细胞增殖的影响

未处理组CNE-2细胞增殖活跃，用浓度为0～20μmol/L的花姜酮作用24～72 h后，对CNE-2细胞增殖无明显影响，当花姜酮浓度增高至30μmol/L后，可明显抑制CNE-2细胞的增殖，因此在随后的研究当中，选用0～20μmol/L的花姜酮为研究浓度。

表1　不同浓度花姜酮对CNE-2细胞活性的影响（±s）

表1　不同浓度花姜酮对CNE-2细胞活性的影响（±s）

注:*与0μmol/L花姜酮相比，P＜0.05。

花姜酮（μmol/L）24 h 48 h　72 h 0 10 20 30 98.32±2.86 97.32±1.22 96.86±2.05 （81.76±2.76）* 101.03±4.32 97.87±6.21 95.76±5.65 （76.86±4.54）* 99.32±2.32 98.65±4.27 96.69±2.53 （71.34±5.01）*

2.2花姜酮对γ-射线照射后对CNE-2细胞增殖的影响

单纯γ-射线照射CNE-2细胞48～72 h后，对细胞生长增殖无明显影响，而预先给予0～20μmol/L的花姜酮处理24 h后，然后继续孵育至72 h，MTT结果显示CNE-2细胞增殖水平随着花姜酮浓度的增高而降低，见表2。

表2　花姜酮对γ-射线照射后对CNE-2细胞增殖的影响（±s）

表2　花姜酮对γ-射线照射后对CNE-2细胞增殖的影响（±s）

注:*与γ-射线相比，P＜0.05。

48 h　72 h花姜酮（0μmol/L）γ-射线γ-射线+10μmol/L花姜酮γ-射线+20μmol/L花姜酮101.03±4.32 96.87±4.54 （86.56±6.76）* （76.63±5.27）* 99.32±2.32 96.08±3.76 （79.95±5.76）* （10.45±3.86）*

2.3花姜酮联合γ-射线对CNE-2细胞周期的影响

花姜酮或γ-射线处理前，细胞以S期为主，当两者处理后，G1期细胞比例有所增加，而S期、G2/M期细胞比例均有下降，随着花姜酮浓度的增加，G1期细胞比例进一步增加见表3。

表3　花姜酮对γ-射线照射后对CNE-2细胞周期的影响（±s）

表3　花姜酮对γ-射线照射后对CNE-2细胞周期的影响（±s）

注:*与γ-射线相比，P＜0.05。

G1S G2花姜酮（0μmol/L）γ-射线γ-射线+10μmol/L花姜酮γ-射线+20μmol/L花姜酮34.7±0.3 33.9±1.1 （47.2±2.6）* （66.9±3.3）* 45.8±0.5 46.4±1.3 （18.6±2.6）* （14.8±4.3）* 19.5±0.7 19.7±1.5 34.2±4.2 18.3±2.8

3　讨论

肿瘤放疗最大的难题就是细胞对射线不敏感。因此，放疗前采用药物干预可能是提高敏感性的途径。有研究表明，某些硝基咪唑类化合物和甲硝唑可增强放疗的效果，但由于其副作用过大而限制了其临床应用［6］。相比之下，某些中药提取物因其副作用低，且对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用而备受青睐。临床药理学研究也表明，花姜酮能抑制细胞生长、抑制血管生成、促进肿瘤细胞凋亡以及抑制迁移与侵袭相关酶类的表达等多种生物学活性。此外，花姜酮也能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此被该研究所采用。

首先该文通过MTT法对γ-射线和花姜酮作为单独处理因素对CNE-2细胞的生长情况进行了观察，结果发现单纯采用0～20μmol/L的花姜酮作用24～72 h后，并不能影响CNE-2细胞的增殖，但其浓度增高至30μmol/L后，可有效降低其活性。同时单纯γ-射线照射CNE-2细胞48～72 h对其生长增殖也无明显影响。而预先给予0～20μmol/L的花姜酮处理24 h后，再给予γ-射线照射后，CNE-2细胞增殖水平随着花姜酮浓度的增高而降低，以上结果表明花姜酮能以剂量依赖性方式增强CNE-2细胞对γ-射线的敏感性。随后通过流式细胞术对CNE-2细胞生长抑制的机制进行了检测，结果发现花姜酮联合γ-射线处理细胞后，G1期细胞比例明显增多，这表明两者联合使用后，抑制DNA合成可能是花姜酮抗鼻咽癌的一个重要机制。总之，该研究证实花姜酮对鼻咽癌CNE-2细胞具有一定的放疗增敏作用，在下一步研究中，将对其信号转导通路开展进一步研究。

［1］夏云飞.以放疗为主的鼻咽癌个体化治疗［J］.广东医学，2014，35（1）：6-8.

［2］范家铭，李静，姜蓉，等.人参多糖对鼻咽癌细胞CNE-2裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及其可能的机制［J］.中国生物制品学杂志，2014，27（4）：538-543.

［3］Chiang MF，Chen HH，Chi CW，et al.Modulation of Sonic hedgehogsignalingandWWdomaincontaining oxidoreductase WOX1 expression enhances radiosensitivity of human glioblastoma cells［J］.Exp Biol Med（Maywood），2015，240（3）：392-399.

［3］Zhang X，Cheung RM，Komaki R，etal.Radiotherapy sensitizationbytumor-specificTRAILgenetargeting improves survival of mice bearing human non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11（18）：6657-6668.

［4］FriedmanGD，SelbyJV.Epidemiologicalscreeningfor potentially carcinogenic drugs［J］.Agents Actions Suppl，1990 （29）：83-96.

［5］Kim S，Lee J，Jeon M，et al.Zerumbone suppresses the motility and tumorigenecity of triple negative breast cancer cells via the inhibition of TGF-β1 signaling pathway［J］. Oncotarget，2016，7（2）:1544-1558.

［6］Fatima A，Abdul AB，Abdullah R，et al.Binding mode analysis of zerumbone to key signal proteins in the tumor necrosis factor pathway［J］.Int J Mol Sci，2015，16（2）：2747-2766.

Effect of Zerumbone on Radiosensitivity of the Nasopharyngeal Cancer Cell Line

LIU Jun，LIAO Jian-xun，TANG Hong-bo，ZHOU Zhi-fang
Department of Otorhinolaryngology，First Hospital Affiliated to Nanhua University，Hengyang，Hunan Province，421001 China

R473.76

A

1672-5654（2016）05（a）-0024-03

刘珺（1979.11-），女，湖南邵阳人，硕士，主治医师，研究方向：耳鼻喉疾病的诊断与治疗。

廖剑绚（1965.9-），女，湖南岳阳人，本科，主任医师，副教授，研究方向:耳鼻咽喉头颈外科，E-mail:278691897@qq.com。

2016-02-14）