siRNA肌细胞特异性增强因子2D对人肺癌细胞株A549和H460增殖及凋亡的影响

石少敏　王　静　赵建军　赵永娟

(吉林大学中日联谊医院呼吸内科，吉林　长春　130033)



siRNA肌细胞特异性增强因子2D对人肺癌细胞株A549和H460增殖及凋亡的影响

石少敏王静赵建军赵永娟

(吉林大学中日联谊医院呼吸内科，吉林长春130033)

〔摘要〕目的探讨siRNA肌细胞特异性增强因子(MEF)2D对人肺癌A549和H460细胞增殖的影响及可能的机制。方法RT-PCR检测正常组织和肺癌组织内MEF2D mRNA的表达水平，siRNA MEF2D转染A549和H460细胞，MTT和流式细胞仪分别检测不同处理组的细胞存活率和凋亡率，Western印迹检测MEF2D和cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果MEF2D mRNA在肺癌组织中的含量比在正常组织内高，细胞转染siRNA MEF2D后，细胞的存活率和MEF2D表达水平下降，而细胞的凋亡率和cleaved caspase-3的表达水平增加。结论siRNA MEF2D抑制了A549和H460细胞的增殖并促进了其凋亡。

〔关键词〕siRNA；肌细胞特异性增强因子2D；肺癌；凋亡

最近有研究报道肌细胞特异性增强因子2D(MEF2D)参与了人类癌症的发生和发展〔1，2〕。但它在肺癌中的具体分子机制还不是十分清楚。本文旨在探讨抑制MEF2D对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料临床正常肺组织样本以及肺癌组织样本(吉林大学中日联谊医院)，肺癌细胞系A549和H460细胞均购自中国医学科学院昆明细胞库。新生牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均为Sigma 公司产品，主要试剂β-actin、cleaved caspase-3购于自美国Santa Cruz公司。MEF2D抗体购于美国BD公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)购于 Millipore 公司。PI 试剂购于Pharmingin公司，OMEGA试剂盒购于北京美科美生物技术开发有限公司，Takara反转录试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司，PCR仪(LightCycler2.0型)为瑞士Roche公司产品；流式细胞仪(FACScaliber)为美国 BD公司产品。

1.2细胞培养前列腺癌细胞铢A549和H460细胞株在含有10%新鲜生牛血清(BSA)、青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 U/ml)的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长至对数生长期时，用0.25%胰酶进行消化，按1∶4比例进行传代。

1.3siRNA-MEF2D转染A549和H460细胞及表达检测利用lipofectamine2000 将 siRNA-MEF2D及对照siRNAs(广州锐博公司购买)分别转染A549和H460细胞，转染6 h后换新培养液，继续培养24 h收集细胞，提取蛋白。BSA分析试剂测定蛋白质浓度。30 μg总蛋白质在10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜，然后5%全脂牛奶封闭2 h。将鼠源性单克隆抗体MEF2D(1∶1 000)一抗与膜孵育1 h，磷酸盐缓冲液(PBST)洗膜3×10 min；羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)二抗(1∶1 000)与膜孵育1 h，PBS洗膜3×10 min；采用ECL试剂盒进行化学发光检测。β-actin为内对照(1∶2 000)。

1.4RT-PCR法在mRNA水平检测MEF2D的表达采用OMEGA试剂盒提取组织和细胞的总RNA，用Takara反转录试剂盒进行反转录，获得总cDNA。MEF2D引物：上游5′-AGGGAAATAACCAAAAAACTACCAAA-3′，下游5′-GCTACATGAACACAAAAACAGAGACC-3′；GAPDH引物：上游5′-GCGAGATCGCACTCATCATCT-3′，下游5′-TCAGTGGTGGACCTGACC-3′。反应条件：逆转录42℃ 30 min；95℃10 min灭活逆转录酶；PCR循环条件为94℃ 60 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s；30个循环后，72℃ 10 min终止延伸。 取RT-PCR产物在 1.2%琼脂糖凝胶中电泳，采用UVP型凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析。

1.5细胞毒性试验MTT法检测MEF2D siRNA、control siRNA对A549和H460细胞增殖的影响。取对数生长期A549和H460 细胞，以8 000个/孔接种于96孔培养板，细胞贴壁后加药，分为3组：调零孔(只含培养液DMEM，无细胞)、对照组(含0.1% DMSO的DMEM 培养液)以及实验组。每组均设3个复孔，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，24 h后转染MEF2D siRNA、control siRNA，转染6 h后换新培养液，继续培养24 h后弃上清，然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液后继续培养4 h，即可弃去孔板内的液体，再每孔加入150 μl DMSO，放于平板振荡器上振荡10 min，酶标仪检测每孔光密度(OD)值(570 nm波长)。每次实验重复3次，取平均值，细胞抑制率=1-(药物组吸光度/对照组吸光度)×100%，计算各组细胞存活率。

1.6Annexin V-FITC/PI 染色后流式细胞仪检测凋亡率将A549和H460细胞接种于六孔板，待细胞长至约75%融合，转染MEF2D siRNA、control siRNA，转染6 h后换新培养液，继续培养24 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后80%冰乙醇固定。-20℃过夜。检测前PBS冲洗细胞1次，制成单细胞悬液，再加入6 μl Annexin V-FITC，最后加入4 μl PI，室温避光孵育15 min后上机检测，每组重复3次。

1.7Western印迹检测不同处理组的A549和H460细胞内cleaved caspase-3表达水平①按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白；②采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后结合一抗(cleaved caspase-3工作浓度为1∶1 000)，第2天加入对应的二抗(1∶1 000稀释)室温孵育1.5 h，洗膜3次，ECL显色液显影，β-actin 为内参。提取结果并分析数据。

1.8统计学方法采用SPSS10.0 软件进行one-way ANOVA分析、t检验。

2结果

2.1正常组织和肺癌组织内MEF2D mRNA表达水平MEF2D mRNA在正常组织中表达量(0.35±0.067)很低，而在肺癌组织中表达表达量(1.02±0.055)很高，两者之间差异显著(P<0.05)。

2.2siRNA MEF2D对A549和H460细胞内MEF2D蛋白的抑制效率siRNA MEF2D及阴性对照转染A549和H460细胞后，siRNA MEF2D明显减弱了A549和H460细胞内MEF2D蛋白的表达。在A549和H460细胞内siRNA MEF2D组与siRNA

control 组之间差异显著(P<0.05)。见表1，图1。

2.3siRNA MEF2D对A549和H460细胞存活率的影响siRNA MEF2D抑制了肺癌细胞的增殖。在A549和H460细胞内siRNA MEF2D组与siRNA control 组之间差异显著(P<0.05)。见表1。

2.4siRNA MEF2D对A549和H460细胞凋亡率的影响siRNA MEF2D增加了A549和H460细胞的凋亡水平。在A549和H460细胞内siRNA MEF2D组与siRNA control 组之间差异显著(P<0.05)。见表1。

2.5siRNA MEF2D对A549和H460细胞cleaved caspase-3蛋白表达的影响siRNA MEF2D增加了两种细胞内cleaved caspase-3蛋白表达水平。在A549和H460细胞内siRNA MEF2D组与siRNA control 组之间差异显著(P<0.05)。见表1，图2。

图1　细胞转染siRNA MEF2D后MEF2D蛋白的表达

指标A549siRNAcontrolA549siRNAMEF2DH460siRNAcontrolH460siRNAMEF2DMEF2D蛋白0.68±0.050.082±0.0221)0.45±0.0470.072±0.0192)细胞存活率(%)100±1.8558.9±1.111)100±2.5155.3±0.852)细胞凋亡率(%)4.31±0.4237.2±1.31)3.86±0.3336.8±0.672)cleavedcaspase-3蛋白0.068±0.030.55±0.0511)0.053±0.0240.43±0.022)

与A549 siRNA control组比较：1)P<0.05；与H460 siRNA control组比较：2)P<0.05

图2　siRNA MEF2D对凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的影响

3讨论

MEF2s起初被认为是对肌细胞分化起到至关重要的核转录因子，随后被证实参与许多生物学过程，包括肌肉组织和神经系统的分化、心脏的形态发生、血管的形成和生长因子调控能力〔3〕。此外，MEF2D在很多细胞中发挥着促存活的作用，环磷酸腺苷-蛋白酶A信号系统会通过负调控MEF2D的功能诱导原代海马神经元的凋亡〔4〕。MEF2s主要包括A、B、C和D四种亚型。MEF2的N端结构域主要负责DNA结合活性和二聚体的形成；而C端结构域的主要作用是作为转录活化结构域〔5，6〕。MEF2s通常在肿瘤组织中高表达，在遗传程序激活方面发挥的作用已经在很多细胞内得到了验证。已有研究表明MEF2C和MEF2D分别通过激活VEGF信号通路和诱导细胞增殖促进了癌症的发展〔7〕。Yu等〔8〕证明了沉默MEF2D能通过抑制RPRM和CDKN1A的表达诱导骨肉瘤细胞周期G2/M期停滞，最终引发了细胞凋亡。但MEF2D在人肺癌细胞中的作用还不是很清楚。本实验结果表明，MEF2D在肺癌组织中表达量要比正常组织中高。通过SiRNA方法成功沉默了MEF2D的表达，与SiRNA control组相比，沉默MEF2D能抑制肺癌细胞的增殖并促进了凋亡。

4参考文献

1Yang Q，Mao Z.Dysregulation of autophagy and Parkinson′s disease：the MEF2D link〔J〕.Apoptosis，2010；15(11)：1410-4.

2Andzelm MM，Cherry TJ，Harmin DA，etal.MEF2D drives photo receptor development through a genome-wide competition for tissue-specific enhancers〔J〕.Neuron，2015；86(1)：247-63.

3Lu J，McKinsey TA，Nicol RL，etal.Signal-dependent activation of the MEF2 transcription factor by dissociation from histone deacetylases〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2000；97(8)：4070-5.

4Salma J，McDermott JC.Suppression of a MEF2-KLF6 survival pathway by PKA signaling promotes apoptosis in embryonic hippocampal neurons〔J〕.J Neurosci，2012；32(8)：2790-803.

5Clark RI，Tan SW，Péan CB，etal.MEF2 is an in vivo immune-metabolic switch〔J〕.Cell，2013；155(2)：435-47.

6Potthoff MJ，Olson EN.MEF2：a central regulator of diverse developmental programs〔J〕.Development，2007；134(23)：4131-40.

7Ma L，Liu J，Liu L，etal.Overexpression of the transcription factor MEF2D in hepatocellular carcinoma sustains malignant character by suppressing G2-M transition genes〔J〕.Cancer Res，2014；74(5)：1452-62.

8Yu H，Sun H，Bai Y，etal.MEF2D overexpression contributes to the progression of osteosarcoma〔J〕.Gene，2015;563(2)：130-5.

〔2015-10-19修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：王静(1976-)，女，副教授，副主任医师，主要从事呼吸系统疾病研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2873-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.021

第一作者：石少敏(1981-)，女，主治医师，主要从事肺癌诊治方面的研究。