龟鹿二仙膏改善围绝经期女性骨质疏松的机制

尚　冰　丛培玮　张丽娜　吴兆利

(辽宁中医药大学中医文献研究院，辽宁　沈阳　110847)



龟鹿二仙膏改善围绝经期女性骨质疏松的机制

尚冰丛培玮1张丽娜1吴兆利2

(辽宁中医药大学中医文献研究院，辽宁沈阳110847)

〔摘要〕目的观察龟鹿二仙膏对人子宫内膜基质细胞(hESCs)增殖和胰岛素样生长因子(IGF)-1表达的影响。方法体外培养hESCs，6孔培养板细胞贴壁达75%～85%后对细胞纯度通过免疫组化法进行鉴定。细胞无血清培养同步化24 h后，龟鹿二仙膏采用不同浓度(10-4、10-6、10-8mol/L)处理细胞48 h，MTT法测定三个浓度下24、36、48 h龟鹿二仙膏对hESCs增殖的影响，Real-time PCR和Western印迹法检测24、36、48 h子宫内膜基质细胞IGF-1 mRNA相对表达量和蛋白含量。结果细胞鉴定波形蛋白阳性率高达95%；10-4、10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组和雌二醇组细胞增殖率显著升高，呈时间依赖性(P<0.05)；36、48 h 10-4mol/L龟鹿二仙膏组细胞增殖明显高于10-6、10-8mol/L组(P<0.05)；10-4mol/L龟鹿二仙膏组可显著促进IGF-1 mRNA的表达和IGF-1蛋白含量(P<0.05)。结论高浓度龟鹿二仙膏能够显著促进hESCs增殖，升高IGF-1 mRNA的表达和IGF-1蛋白含量。

〔关键词〕龟鹿二仙膏；子宫内膜基质细胞；骨质疏松；胰岛素样生长因子1

雌激素的降低是骨质疏松(OP)发生的最主要原因〔1〕。龟鹿二仙膏是古代著名的抗衰老膏方，由鹿角胶、龟板胶、枸杞子、人参四味组成，具有生精、益气、养血的功效，古医籍中多见有运用该方调理女性健康。龟鹿二仙膏对改善女性血液循环，提高性激素含量，均有显著疗效〔2，3〕。前期临床调查显示，龟鹿二仙膏对围绝经期综合征患者治愈率高达93.75%〔4〕，OP明显改善。子宫内膜是一个由激素调节经历动态改变的组织，在性激素的作用下内膜细胞发生周期性的变化。本次研究通过体外培养hESCs，观察不同浓度龟鹿二仙膏对基质细胞增殖的影响，以及对骨质疏松骨重建过程中发挥重要作用的胰岛素样生长因子(IGF)-1〔5〕基因和蛋白表达的影响，探讨龟鹿二仙膏对改善围绝经期女性OP的作用与机制。

1资料与方法

1.1材料来源选取2014年5～11月辽宁中医药大学附属医院产科因妇科良性疾病行腹腔镜检查患者15例，年龄25～45岁，术后病理显示为正常增生期子宫内膜，术前3个月未应用过激素类药物，刮宫获取足够数量的子宫内膜，转移至4℃保存的装有细胞培养液的小瓶中，将小瓶置于低温保温桶30 min内送至实验室，所取标本均与患者签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1主要试剂龟鹿二仙膏(上海中医药大学龙华医院药局)；DMEM-F12培养液、胎牛血清(Hyclone)；青链霉素混合液(Genview)；胶原酶、人雌二醇E2(Sigma)；兔抗人波形蛋白抗体、鼠抗人角蛋白抗体(Abcam)；兔抗人IGF-1抗体(sc-9013)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体、羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(Santa)；RNA反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Green I(TaKaRa)。

1.2.2组织处理与细胞培养参照Arnold 法〔6〕，分离并获取人子宫内膜基质细胞(hESCs)。超净工作台取出内膜组织倒入无菌培养皿中，PBS冲洗3遍。剪至1 mm3左右的碎片，加入2倍体积的0.125%胶原酶，37℃恒温水浴箱内消化60 min，每5 min取出拍打助消化，细胞培养液终止消化。悬浮液经38 μm不锈钢滤网过滤，PBS冲洗，将滤液(主要为基质细胞)转入离心管中，1 200 r/min离心15 min，弃上清，10%FBS DMEM-F12细胞培养液悬浮，计数，以5×105～6×105/ml接种于培养瓶中，37℃、5%CO2细胞培养箱培养。24 h细胞贴壁后换液，细胞贴壁达90%以上后1∶3传代至6孔板。

1.2.3 hESCs的鉴定倒置显微镜下观察6孔板中细胞爬片，2 d后，贴壁达75%细胞免疫组化鉴定细胞表型。采用兔抗人波形蛋白一抗和鼠抗人角蛋白一抗，二抗孵育，DAB 显色，苏木素复染，显微镜下观察。

1.2.4不同浓度龟鹿二仙膏的处理第二代hESCs经胰酶消化，细胞贴壁达75%以上后，接种于6孔板，更换无血清培养液饥饿培养，细胞同步化24 h后弃培养液，分为对照组、龟鹿二仙膏组(10-4、10-6、10-8mol/L)、雌二醇(10-4、10-6、10-8mol/L)组。对照组加入10%FBS DMEM-F12细胞培养液，龟鹿二仙膏组按照10-4、10-6、10-8mol/L加入对应含龟鹿二仙膏血清培养液200 μl，每组8复孔，37℃、5%CO2细胞培养箱继续培养24、36、48 h。雌二醇组(阳性对照)与龟鹿二仙膏组设计一致，计算细胞增殖率=(药物组/对照组)×100%。

1.2.5MTT法检测hESCs增殖率96孔板每孔加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育4 h，弃孵育液每孔加入DMSO 100 μl。雌二醇组作为阳性对照组，酶标仪492 nm测定OD值。

1.2.6Real-time PCR测定IGF-1 mRNA表达龟鹿二仙膏处理48 h后收集细胞，RNAiso Plus 试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度：A260 nm/A280 nm在1.8～2.2之间。去除基因组DNA，反转录RT反应和SYBR Green I相对定量分析。反转录按如下条件反应：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。实时定量PCR反应条件：95℃ 10 s，95℃ 20 s，60℃ 35 s，32个循环。引物序列：IGF-1基因IGF-1基因(上游5’-ATGGGAAAAATCAGCAGTCTTC-3’，下游5’-CTACATCCTGTAGTTCTTGTTT-3’)；β-actin基因(上游5’-GCACAGCCTGGATAGCA-3’，下游5’-CACCAACTGGGACGACAT-3’)。

1.2.7Western印迹测定IGF-1蛋白含量将对数生长期的hESCs以2.0×105个/孔的密度接种于6孔板中，每组设3个复孔。按实验分组处理细胞，分别在24、36、48 h收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。取80 μg蛋白进行二烷基硫酸钠-聚丙烯乙胺凝胶电泳，电泳完毕后以150 V恒压30 min半干转印至PVDF膜，将膜用5%脱脂奶粉常温下摇床封闭2 h，

加入兔抗IGF-1一抗(稀释比例均为1∶100)，4℃过夜。TBST洗膜3次，15 min/次；二抗常温下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，化学发光法显影。

1.3统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1细胞免疫组化鉴定波形蛋白特异性地标记hESCs，角蛋白特异性标记腺上皮细胞。波形蛋白染色阳性hESCs，形态多为纺锤形或多角形，波形蛋白染色阳性率达95%，阳性细胞胞质呈棕黄色，以核周染色较为明显，核蓝染。角蛋白染色阳性的细胞，角蛋白在hESCs染色中呈阴性，波形蛋白阳性染色率达95%。见图1。

2.2各组细胞增殖情况随着作用时间增长，龟鹿二仙膏组和雌二醇组细胞增殖率显著升高，呈时间及剂量依赖性(P<0.05)。24 h，10-4、10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组间细胞增殖率差异不显著(P>0.05)。36、48 h，10-4mol/L龟鹿二仙膏组细胞增殖明显高于10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组(P<0.05)。与同浓度雌二醇组比较，24 h龟鹿二仙膏组细胞增殖率无明显差异(P>0.05)；36 h，10-4mol/L龟鹿二仙膏组细胞增殖率差异不显著(P>0.05)，10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组细胞增殖率差异显著(P<0.05)；48 h，10-4、10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组细胞增殖率差异不显著(P>0.05)。见表1。

图1　hESCs免疫组化染色鉴定结果(×400)

浓度(mol/L)龟鹿二仙膏组24h36h48h雌二醇组24h36h48h10-871.87±1.1699.87±1.151)2)3)125.54±1.311)3)70.34±1.06120.44±1.123)128.51±1.371)3)10-673.16±1.19101.41±1.711)2)3)135.97±1.331)3)72.87±1.51121.31±1.143)137.47±1.201)3)10-473.77±1.10121.24±2.033)149.65±1.273)75.02±1.15123.07±1.033)150.17±1.163)

与10-4mol/L相比较：1)P<0.05；与同浓度雌二醇组相比较：2)P<0.05；与同组同浓度组前一时间点相比较：3)P<0.05

2.3龟鹿二仙膏对IGF-1 mRNA表达的影响10-6和10-8mol/L龟鹿二仙膏组IGF-1 mRNA相对表达量随着作用时间延长有显著升高(P<0.05)，36 h和48 h，10-4mol/L龟鹿二仙膏组和10-6mol/L雌二醇组IGF-1 mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)。24、36、48 h对照组与同时间段内其余各组间IGF-1 mRNA相对表达量呈显著差异(P<0.05)。与对照组比较，IGF-1 mRNA的表达在10-4mol/L龟鹿二仙膏组作用hESCs 36 h、48 h后最为显著(P<0.01)，10-6mol/L与雌二醇组间比较无统计学差异，且呈时间及剂量依赖性。见表2。

2.4龟鹿二仙膏对IGF-1 蛋白表达的影响IGF-1蛋白表达随着作用时间延长也呈现上升趋势。24 h与对照组比较，各组均有显著差异(P<0.05)，36 h，10-4mol/L龟鹿二仙膏组和10-6mol/L雌二醇组IGF-1蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)；10-4mol/L龟鹿二仙膏组和10-6mol/L雌二醇组IGF-1 蛋白表达量显著高于10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组(P<0.05)。48 h，10-4mol/L龟鹿二仙膏组和10-6mol/L雌二醇组IGF-1 蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)；10-4mol/L龟鹿二仙膏组和10-6mol/L雌二醇组IGF-1 蛋白表达量显著高于10-6、10-8mol/L龟鹿二仙膏组(P<0.01)。见图2、表3。

表2　不同时间点各组hESCs IGF-1 mRNA表达变化

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与10-4mol/L龟鹿二仙膏组比较：3)P<0.01，下表同

1：对照组；2：10-8 mol/L龟鹿二仙膏组；3：10-6 mol/L龟鹿二仙膏组；4：10-4 mol/L龟鹿二仙膏组；5：10-6 mol/L雌二醇组图2　不同时间点各组hESCk IGF-1蛋白表达

组别剂量(mol/L)IGF-1/β-actin相对表达量24h36h48h对照组-1.54±0.131.62±0.081.59±0.21雌二醇组10-62.35±0.151)3.94±0.162)4.28±0.272)龟鹿二仙膏组10-42.31±0.061)3.85±0.182)4.19±0.092)10-62.27±0.071)2.98±0.271)3)3.13±0.141)3)10-81.98±0.171)2.21±0.211)3)2.95±0.181)3)

3讨论

骨成熟后，骨组织不断经历破骨细胞对旧骨吸收和伴随其后成骨细胞形成新骨的动态平稳过程，围绝经期女性雌激素减少促使骨吸收超过骨形成，出现骨丢失，发生OP〔7〕。龟鹿二仙膏是古代著名的补肝肾、抗衰老膏方，首见于《医方考·虚损劳瘵门》，因符合女性生理和病理特点，为许多中医妇科专家临床用于女性健康调理。实验表明其能明显增加未成年小鼠、大鼠包皮腺、精液囊和前列腺重量，防治肾阳虚小鼠附性器官萎缩；提高性激素含量有显著效果〔8〕。

子宫内膜在性激素的作用下发生周期性变化，雌激素能促进子宫内膜和间质细胞有丝分裂，引起子宫内膜基底层和腺体、间质、血管增生、增厚〔9〕。有研究指出雌二醇对子宫内膜上皮细胞的增殖具有促进作用，而基质细胞在上皮细胞的生长发育和功能方面发挥着重要调节作用〔10〕。Arnold等〔6〕研究发现基质细胞可促进上皮组织形成，并调控其分化。本研究结果显示：龟鹿二仙膏组hESCs增殖率随作用时间增长显著升高。

目前研究发现雌激素与IGF-1水平呈正相关。舒强等〔11〕发现绝经后OP组患者血清中IGF-1 水平低于绝经前正常妇女组及绝经后非OP组，受试者的血清IGF-1 水平与骨密度(BMD)、雌二醇呈显著正相关。Kassem等〔12〕发现17-雌二醇以时间和剂量相关的方式增加IGF-1 mRNA水平，认为IGF-1基因是雌激素作用的靶基因，提示IGF-1介导了雌激素对人骨的部分作用。Posaci等〔13〕发现雌二醇可通过成骨细胞上的雌激素受体在转录水平提高IGF-1的合成，而且应用雌激素替代治疗也可显著增加血清IGF-1水平。Reed等〔14〕发现原发性OP患者血浆IGF-1水平与成骨细胞活性指标密切相关，体外培养中IGF-1可呈剂量依赖性刺激OB前体的增殖及向OB的分化、促进碱性磷酸酶、骨钙素等成骨标志物的表达。国外已有医生开始将IGF-1用于试验性治疗OP，给18名健康绝经妇女服用不同剂量rhIGF-1共6 d，发现血清中Ⅰ型胶原羧端前肽每日上升14%，尿胶原交联排出率上升9%，骨转化加速，骨形成增加更显著。本研究结果显示：36、48 h，10-4mol/L龟鹿二仙膏组IGF-1 mRNA、蛋白表达水平与雌二醇组比较无明显差异。

本研究发现，龟鹿二仙膏对子宫内膜基质细胞有显著增殖作用，其调控基质细胞增殖机制可能与间接调节卵巢相关激素水平相关。对OP骨重建过程中发挥重要作用的IGF-1基因在龟鹿二仙膏作用下，水平有显著变化，提示龟鹿二仙膏改善围绝经期女性OP的机制可能与调控IGF-1的表达相关。

4参考文献

1王艳丽，谭丽.围绝经期女性骨质疏松的临床研究〔J〕.中国实用医药，2007；20(2)：26-7.

2和新.龟鹿二仙膏治疗虚劳证100例临床疗效观察〔J〕.时珍国医国药，1999；10(10)：782.

3文建华，朱明方.龟鹿二仙胶囊治疗虚损衰老证的临床观察〔J〕.湖南中医学院学报，2002；4(1)：43.

4吴兆利.龟鹿二仙膏方证探讨及临床应用〔J〕.中医临床研究，2014；17(6)：69-70.

5程志安，肖劲夫.胰岛素样生长因子与骨质疏松〔J〕.中国骨质疏松杂志，2001；7(1)：85-7.

6Arnold JT，Kaufman DG，Markku S，etal.Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro：a new coculture model〔J〕.Hum Reprod，2001；16(5)：836-45.

7李慧林，朱汉民.激素治疗预防绝经后妇女骨质疏松症WHI后精析〔J〕.中国骨质疏松杂志，2011；17(2)：172-5.

8俞丽霞.中成药药理学〔M〕.杭州：浙江大学出版社，2007：199.

9Kyo S，Nakamura M，Kiyono T，etal.Successful immortalization of endometrial glandular cells with normal structural and functional characteristics〔J〕.Am J Pathol，2003；163(6)：2259-69.

10Pierro E，Minici F，Alesiani O，etal.Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium〔J〕.Biol Reprod，2001；64(3)：831-8.

11舒强，王桂兰，董建军，等.绝经后骨质疏松与胰岛素样生长因子〔J〕.中国骨质疏松杂志，1999；5(1)：28-31.

12Kassem M，Okazaki R，Harris SA，etal.Estrogen effects in insulin-like growth factor gene expression in a human osteoblastic cell line with high levels of estrogen receptor〔J〕.Calcif Tissue Int，1998；62：60-6.

13Posaci C，Altunyurt S，Islekel H，etal.Effects of HRT on serum levels of IGF-Ⅰin postmenopausal women〔J〕.Maturitas，2001；40：69-74.

14Reed BY，Zerwekh JE，Sakhaee K，etal.Serum IGF-Ⅰis low and correlated with osteoblastic surface in idiopathicosteoporosis〔J〕.Bone Miner Res，1995；10：1218-24.

〔2015-12-09修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

基金项目：辽宁省科技厅科技攻关层次计划项目(No.2012225018)

通讯作者：吴兆利(1965-)，女，教授，医学博士，硕士生导师，主要从事中医药对脏腑调控作用的信号转导机制研究。

〔中图分类号〕R274

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2847-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.009

1辽宁中医药大学教学实验中心2辽宁中医药大学针灸推拿学院

第一作者：尚冰(1974-)，男，副教授，医学博士，主要从事中医药对脏腑调控作用的信号转导机制研究。