MicroRNA-499b通过亚甲基四氢叶酸还原酶调节老年慢性心力衰竭患者血清同型半胱氨酸水平的机制及意义

王　晟　龙　静　胡金牛　邓炳取　占达良　谭战荣

(海口市第三人民医院老年病科，海南　海口　571100)



MicroRNA-499b通过亚甲基四氢叶酸还原酶调节老年慢性心力衰竭患者血清同型半胱氨酸水平的机制及意义

王晟龙静胡金牛邓炳取占达良谭战荣

(海口市第三人民医院老年病科，海南海口571100)

〔摘要〕目的探究MicroRNA(MiR)-499b在老年慢性心力衰竭(CHF)患者中的表达情况及其对血清同型半胱氨酸(Hcy)含量的影响。方法利用老年CHF患者的组织芯片，通过原位杂交检测MiR-499b mRNA表达水平；利用荧光素酶和Western印迹检测MiR-499b对其靶基因亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的表达调控；通过检测血清中的Hcy表达情况，显示MiR-499b和MTHFR对Hcy逆转产生的影响；利用荧光素酶和Western印迹实验检测MiR-499b对肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达调控，显示MiR-499b和TNF-α对CHF逆转产生的影响。结果MiR-499b在老年CHF患者中显著降低，并且正向调控MTHFR的表达水平；MiR-499b直接靶向调控MTHFR启动子活性，增高MTHFR的蛋白表达水平，下调Hcy的表达水平，并且发现MiR-499b能够靶向调控TNF-α，降低其表达水平，进而CHF炎症水平，降低心衰发生率。结论MiR-499b的低表达与血清Hcy的异常表达具有显著相关性，MiR-499b通过增强MTHFR的表达降低血清Hcy的表达量；MiR-499b能够降低TNF-α的表达水平，减少CHF的发生。

〔关键词〕慢性心力衰竭;同型半胱氨酸;MicroRNA;肿瘤坏死因子-α

慢性心力衰竭(CHF)患者中普遍存在蛋白质定性和定量缺乏，这将导致肌肉和内脏蛋白质代谢混乱〔1,2〕。通过检测血清中的同型半胱氨酸(Hcy)水平可以初步判断患者体内是否存在蛋白质代谢异常〔3～5〕。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变是导致血浆 Hcy 轻度升高的重要原因〔6〕;CHF患者体内，某些炎症因子的表达也存在异常升高，如肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-6等〔7〕。根据现有文献报道，MicroRNAs可能参与CHF的发病过程〔8〕，但其机制尚不清楚。本文旨在探讨MicroRNA(MiR)-499b在老年CHF患者中的表达情况，并且探究该条件下MiR-499b对血清Hcy水平的影响。

1材料与试剂

1.1细胞与试剂293T细胞由本实验室保存，DMEM高糖培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶购自研科生物公司；一抗及二抗购自武汉三鹰公司；细胞培养板购自Costar公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce Chemical公司，5×SDS蛋白上样缓冲液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、过硫酸铵、脱脂奶粉购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；D-Hank缓冲液为自行配制。

1.2仪器倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；CO2培养箱购自美国Forma公司；-80℃冰箱为中国海尔集团产品；板式酶标仪购自北京市新风机电技术公司；电泳仪及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；单光子仪。

1.3方法

1.3.1原位杂交对含有30例老年CHF患者的组织芯片进行原位杂交实验，检测组织中MiR-499b的表达情况。

1.3.2细胞培养293T细胞用含有15%胎牛血清的DMEM 培养基培养，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中常规培养。用含0.02%EDTA 的0.25% 胰酶消化液消化细胞，并进行传代，传至4、5代左右，选取生长状态良好、增殖旺盛的细胞用于实验研究。

1.3.3建立稳定干扰MiR-499b的细胞系293T细胞培养于含10%胎牛血清的培养基中，置细胞培养箱中传代培养。取对数生长期的细胞做实验。在六孔板中种入生长状态良好的细胞，当细胞密度达到50%～60%时，将转染细胞分3组:(1)293T细胞:常规培养，不做任何处理;(2)anti-miR-NC/293T细胞:瞬时转染插入空载质粒;(3)干扰MiR-499b的293T细胞(anti-miR-499b):瞬时转染插入MiR-499b目标片段 5'-GTTTATTAAGTCACATGCT-3'和 5'-CATCAATTCTGTGCTCTGG-3'。同时用脂质体2000进行平行转染，6 h以后换液，用G418进行筛选，利用Western印迹进行鉴定。

1.3.4Hcy检测利用试剂盒(上海科华生物工程股份公司)提供的循环酶法检测293T细胞、anti-miR-NC/293T细胞和干扰MiR-499b的293T细胞(anti-miR-499b)中Hcy含量。

1.3.5MTHFR和TNF-α mRNA表达的检测首先用TRIzol提取细胞总RNA，将总RNA逆转录合成cDNA。反应条件:42℃ 60 min，70℃ 10 min。以产物cDNA 为模板，使用实时PCR检测MTHFR和TNF-α mRNA的相对表达量，每个样品设置3个复孔。内参照为GAPDH。各引物序列:MTHFR正向序列5'-GTCACCGAGGTCTGAAACAAG-3'，反向序列5'-TCTGGGACCTGAGGTAGAGG-3';GAPDH 正向序列5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，反向序列5'-TCTAGTCGACGGCAGAGGTC-3'。实时PCR反应条件:95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39个循环。溶解曲线条件:95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。根据反应结束后的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时对应的循环数)，通过2-△△Ct法计算样品中多种mRNA 的相对表达量，所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.6荧光素酶活性检测将293T细胞接种于24孔培养板中，待细胞生长至70%～85%融合度时，共转染荧光素酶报告载体及阴性对照、anti-miR-NC和anti-miR-499b。以转染pRL-TK作为标准内质控。转染48 h后，收获细胞。按Promega公司双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测细胞荧光素酶活性：弃去细胞培养液，PBS清洗3次，然后每孔加入已稀释的1×PLB裂解细胞10 min。将细胞刮下，收集至1.5 ml EP管中，12 000 r/min离心3 min，取上清。取25 μl上清，加入荧光素酶检测试剂LARll 100 μl，记录萤火虫荧光素酶活性值；然后加入stop&Glo试剂100 μl，记录海肾荧光素酶活性值。计算相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.3.7相关蛋白表达的检测采用 Western印迹法。

1.3.7.1蛋白样品的获得蛋白裂解液的配制(100 μl)：取100×蛋白酶抑制剂 1 μl，加蛋白裂解液至100 μl。蛋白抽提：用预冷的D-Hank液清洗3次，每一个孔加入蛋白裂解液，将其置于冰上裂解30 min，用细胞刮刀将孔中细胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，4℃ 12 000 r/min离心30 min，离心完毕后将其取出置于冰上，分装备用。

1.3.7.2BCA法蛋白定量采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit进行。

1.3.7.3蛋白变性按比例加入5×SDS蛋白上样缓冲液，置于金属浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷却，最后放于-20℃冰箱保存备用。

1.3.7.4Western印迹分析(1)电泳：根据待检测蛋白质的大小选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每泳道上样40 μg，先70 V电泳30 min，再130 V电泳至溴酚蓝染料跑出胶后停止电泳，冰上进行。(2)转膜：断掉电源，取出电泳板，根据样品数量及蛋白分子量大小剪下合适大小的胶，用尺子量好长和宽后放置于盛有转膜液的平皿中。根据胶的尺寸裁剪合适孔径的PVDF膜以及专用滤纸，按照滤纸、胶、PVDF膜、滤纸顺序放置，将转膜板卡紧，放入转膜槽中，打开电源100 V恒压转膜1～2 h(根据蛋白的大小不同而不同，蛋白分子量大的转膜时间久)。(3)封闭：5%脱脂牛奶，用TBST稀释，室温封闭1 h。(4)一抗孵育：按照抗体说明书用TBST将一抗稀释到适合的比例。 (5)洗膜：将PVDF膜转入洗膜盒中，正面向上，加入适量的TBST液体，置于摇床上下洗涤3次，10 min/次。(6)二抗孵育：根据实验所用一抗的种属选择对应的二抗，并用TBST将二抗稀释到适合的比例，并将其置于摇床上室温孵育1 h。(7)洗膜：将PVDF膜转入洗膜盒中，正面向上，加入适量的TBST液体，置于摇床上下洗涤3次，10 min/次。(8)显影：在膜表面滴入适量的HRP化学显影液，使之覆盖膜的整个表面，在凝胶成像系统中拍照保存。

1.4统计学方法采用SPSS18.0软件进行t检验。

2结果

2.1在老年CHF患者的组织芯片中检测MiR-499b的表达情况原位杂交实验检测发现，老年CHF患者体内MiR-449b mRNA的表达水平发生异常性减少。见图1。

2.2稳定转染干扰MiR-499b的293T细胞系的鉴定通过实时荧光定量检测mRNA水平，阴性对照组、anti-miR-NC组、anti-miR-499b组MiR-499b mRNA表达水平依次为1.0±0.77、0.97±0.80、0.33±0.39，干扰效率达到70%以上，结果可信。

2.3Hcy含量的测定干扰MiR-499b的293T细胞系产生的Hcy含量(3.87±1.1)明显高于其他两组(阴性对照组1.1±0.29,anti-miR-NC组0.96±0.47)(P<0.05)；而其他两组之间的Hcy含量无统计学差异。

2.4MiR-499b MTHFR和TNF-α mRNA表达的检测干扰MiR-499b组的MTHFR mRNA表达量相比对照组明显降低；干扰MiR-499b组的TNF-α mRNA表达量相比对照组明显升高(P<0.05)。DNA凝胶电泳显示一致的结果，见表1，图2。

图1　正常组与CHF组MiR-499b mRNA表达水平

组别TNF-αmRNAMTHYmRNA阴性对照组0.31±1.051)1.03±0.41)anti-miR-NC组0.34±0.671)1.1±0.191)anti-miR-499b组0.96±0.890.54±0.39

与anti-miR-499b组比较:1)P<0.05

图2　DNA凝胶电泳图

2.5荧光素报告分析结果通过在线靶基因软件预测发现，MiR-499b可能与MTHFR mRNA的3'-UTR片段3 864～4 060 bp相结合，且该结合位点在多物种间高度保守。构建报告载体后，通过荧光素活性检测，结果显示，与MiR-499b组比较，anti-miR-499b能够明显抑制MTHFR-Mt报告载体的荧光素酶活性(P<0.05)，但是对突变型的MTHFR-Mut无明显抑制作用。见图3。

图3　miR-499b对MTHFR mRNA的3'-UTR的调控情况

2.6利用已经鉴定成功构建的anti-miR-499b 293T细胞系进行恢复实验向anti-miR-499b 293T细胞中转入anti-miR-499抑制剂恢复MiR-499b的表达水平，检测MTHFR和TNF-α的蛋白水平，当MiR-499b过表达时MTHFR蛋白表达水平显著上升(P<0.05)，而TNF-α蛋白水平显著下降。见图4。

A: control;B: NC;C: anti-miRNA-499b抑制剂;D:anti-miRNA-499b图4　miR-499b的变化对MTHFR和TNF-α蛋白水平的影响

3讨论

根据统计，老年CHF患者大多存在蛋白质代谢失衡，研究表明血浆中的NT-proBNP、TNF-α等因子也在CHF的发生过程中存在着异常活化的情况〔9～11〕。根据现有报道证明，在CHF时，MicroRNA会发生表达水平的异常，而这些异常性变化可能会对该病的发生和发展产生影响〔12，13〕。事实上,MicroRNA可以抑制或促进CHF的进程,靶向其下游目标〔14〕。

本研究提示，MiR-499b在CHF中可能是作为一种抑制疾病发生方面的因子行使功能。本实验发现，沉默MiR-499b后，对Hcy的产生能力存在影响，MiR-499b的沉默能够明显降低MTFHR的表达能力。本实验进一步说明体内容易发生蛋白质代谢的混乱；另外，MiR-499b能够降低TNF-α的表达水平，还能够降低炎症的发生，减缓CHF的进程。

总之，老年CHF与MiR-499b低表达有关。Mir-499b可以

通过增强MTFHR的表达来降低Hcy的积累，维持体内的蛋白质平衡；并且Mir-499b也可以通过降低TNF-α的表达来减缓炎症的发展进程，从而减缓CHF的发展速度。

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〔2015-11-19修回〕

(编辑李相军)

基金项目：海南省卫计委科研项目(14A200043)

〔中图分类号〕R541

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2860-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.015

第一作者：王晟(1967-)，男，副主任医师，主要从事老年病研究。