复方白鲜皮抗菌凝胶剂的制备及质量控制

周爱媚，汪 妍，方圆圆，陈 菲

（金华职业技术学院，浙江 金华 321007）

复方白鲜皮抗菌凝胶剂的制备及质量控制

周爱媚，汪 妍*，方圆圆，陈 菲

（金华职业技术学院，浙江 金华 321007）

目的 制备复方白鲜皮抗菌凝胶剂，并用高效液相（HPLC）法测定复方白鲜皮抗菌凝胶剂中白鲜碱的含量。方法 以白鲜碱为指标成分控制含量，用闪式提取法提取白鲜皮和苦参混合物浓缩液，确定了以1.0%卡波姆-940、1.0%冰片、10%甘油、5%乙醇、0.2%聚山梨酯80、0.1%羟苯乙酯、1.35%三乙醇胺为处方组成，通过外观和稳定性观察实验确定复方白鲜皮抗菌凝胶剂制备工艺。结果 凝胶剂外观性状为淡黄色晶莹透明状胶体，气微清香；pH值约为6.7；稳定性试验表明本品各指标均无明显改变，皮肤刺激性试验表明本品对皮肤无明显刺激，手足癣主要致病真菌的抑菌试验表明该制剂对皮肤表面自然菌的除菌率为71.8%。结论 本制备方法简便可行，分析方法可用于控制白鲜皮抗菌凝胶剂中有效成分的含量。

复方白鲜皮抗菌凝胶剂；制备；质量控制

白鲜皮为芸香科白鲜属植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮，是一种常用中药，为历代本草及《中国药典》收载。白鲜皮属于多年生草本，根皮外表面呈淡灰黄色、内表面类白色，肉质脆，味微苦，寒。具有清热燥湿、祛风止痒、解毒之功效，临床上用于治疗湿热疮毒、湿风疹、疥癣疮癞、风湿热痹、神经性皮炎等慢性顽固性皮肤病[1]等，并对心血管及血液病有一定疗效，特别是对皮肤类疾病有很好的治疗作用，如对皮肤瘙痒，湿热疮疡，阴部肿痛等病症都有一定的功效。化学研究表明，其中的白鲜碱和梣酮是主要有效成分，具有显著活性[2]。目前西医临床上主要用抗真菌软膏类药物来治疗手足癣，但由于合成的抗真菌药物不良反应多，易产生耐药性，还有一定的毒副作用，真菌感染治疗仍然面临许多挑战[2]。鉴于中药副作用小，来源广，价格低廉，较少出现耐药性，因此从天然药物中寻找安全性好、抗菌谱广、疗效高的抗真菌抗细菌成分已成为重要的研究方向[3]。因而本实验筛选出具有清热祛湿、凉血解毒、杀虫止痒等功效的中药白鲜皮和苦参作为复方药材，以白鲜碱为指标成分提取其浓缩液，并将复方白鲜皮浓缩液制备为凝胶剂[4]。本文经过对复方白鲜皮进行高效液相（HPLC）法含量控制，验证其有效成分的含量，从而促进复方白鲜皮抗菌凝胶剂的临床应用。

1仪器与试药

1.1仪器

闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司）、F1004型电子天平（上海天平仪器厂）、高速药材粉碎机（浙江金华华盛实业有限公司）、HH-6数显恒温水浴锅（常州恒德仪器制造有限公司）、BC-R501旋转蒸发仪（上海盛玻仪器有限公司产品）、Waters2487高效液相色谱仪、2487紫外分光检测器、Breeze色谱工作站、DHP-9052型电热恒温培养箱（上海和呈仪器制造有限公司）、LDZX-75KBS高压灭菌器（上海楚柏实验室设备有限公司）、净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、酸碱测试仪、研钵等。

1.2试剂

白鲜皮、苦参（购自金华三溪堂国药馆）、甘油、卡波姆-940（青岛美生源生物科技有限公司）、乙醇（深圳市天时化工有限公司）、聚山梨酯80（上海山浦化工有限公司）、三乙醇胺（上海化学试剂有限公司）、稀盐酸（无锡阳山生化有限责任公司）、羟苯乙酯（上海山浦化工有限公司）、冰片（天津市化学试剂公司）、色谱级甲醇（北京京科瑞达有限公司）、去离子纯化水等。金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum）、犬小孢子菌（Microsporum canis）、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）、絮状表皮癣菌（Epidermophyton floccosum）由金华职业技术学院基础医学实验中心提供。

1.3对照品

白鲜碱标准品（购自中国药品生物制品鉴定所）。

2方法与结果

2.1复方白鲜皮浓缩液制备

将白鲜皮和苦参（3∶1）打碎磨粉后称取40 g于闪式提取器中，以1∶10的料液比加入80%的乙醇溶液，提取电压为60 V，提取时间为2 min，过滤，收集滤液，浓缩和真空冷冻干燥，用80%乙醇溶解并定容至200 mg.ml-1备用。取复方白鲜皮提取液200 ml（白鲜皮∶苦参=3∶1），用旋转蒸发仪旋转蒸发除去溶剂，遗留残渣加80%乙醇液20 ml溶解，过滤，滤液用80%乙醇定容至20 ml，制成每1 ml含2 g药材的溶液。

2.2凝胶剂的制备

2.2.1凝胶基质处方基质处方组成：卡波姆-940[5，6]1.0 g，甘油10 g，乙醇5 g，聚山梨酯80 0.2 g，羟苯乙酯0.1 g，三乙醇胺1.35 g，蒸馏水加至100 ml。

制备方法：将卡波姆-940播撒入甘油表面，用研磨法使其充分浸润完全后，再加10 ml蒸馏水研磨细腻，加50 ml水，使之充分溶胀。将三乙醇胺、聚山梨酯80溶于5 ml水后加入上液研磨，再将羟苯乙酯溶于乙醇逐渐加入搅匀，加蒸馏水至全量，搅拌均匀即得。

结果观察：呈胶冻状，透明清亮细腻，光泽度好，长时间放置稳定。

2.2.2复方白鲜皮凝胶剂制备（1）处方设计：冰片[7]1.0 g，复方白鲜皮浓缩液5 ml，卡波姆-940 1.0 g，甘油10 g，乙醇5 g，聚山梨酯80 0.2 g，羟苯乙酯0.1 g，三乙醇胺1.35 g，蒸馏水加至100 g。

（2）制备工艺的优化。制备方法一：将卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸润完全后，加入复方白鲜皮浓缩液5 ml和5 ml溶有冰片和羟苯乙酯的乙醇溶液；再加50 ml蒸馏水研磨细腻，使之充分溶胀；将三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨，再加蒸馏水至全量，搅拌均匀即得。

制备方法二：将卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸润完全后，加10 ml蒸馏水使之充分溶胀；加入复方白鲜皮浓缩液5 ml和5 ml溶有冰片和羟苯乙酯的乙醇溶液，再加40 ml蒸馏水研磨细腻；将三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨，再加蒸馏水至全量，搅拌均匀即得。

制备方法三：将卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸润完全后，再加50 ml蒸馏水研磨细腻，使之充分溶胀；将三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨；加入复方白鲜皮浓缩液5 ml和5 ml溶有冰片和羟苯乙酯的乙醇溶液，再加蒸馏水至全量，搅拌均匀即得。

2.2.3结果考察（见表1）通过对3个成品进行外观性状观察和长时间放置稳定性观察两个指标确定制备方法的优劣，经过综合评价，制备方法二被筛选为实验最佳制备方法。

表1 各制备方法考察结果

2.3凝胶剂含量测定

2.3.1色谱条件色谱条件：以Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以甲醇—水（V/V=70∶30）为流动相；流速：0.5 ml/min；柱温25℃；检测波长：237 nm；灵敏度：0.5AUFS；进样量：20 μl。理论塔板数以白鲜碱计不低于5 000。

2.3.2供试品溶液的制备 取凝胶剂样品5 g，精密称定，置于50 ml锥形瓶中，加流动相（甲醇∶水=70∶30）约15 ml，超声20 min，放置至室温，转移至25 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。摇匀，离心10 min，取其上清液过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3对照品溶液的制备 称取白鲜碱标准品适量，置于100 ml容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.664 mg/ml的白鲜碱对照品溶液。

2.3.4测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3.5标准曲线及线性范围 精密吸取白鲜碱对照品用流动相依次稀释定容，配制成1.05、4.2、8.4、16.8、33.2、66.4 μg·ml-1系列浓度，分别进样，以白鲜碱对照品质量浓度X对白鲜碱色谱峰面积Y做标准曲线，得回归方程分别为：y=740 444.85x+ 2 265 470.91，r2=0.999 3（n=6）。即呈良好线性关系。

2.3.6精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，连续测定5次，记录峰面积积分值，并以峰面积计算RSD值。结果表明，该仪器精密度良好，可靠性强。

2.3.7稳定性试验 精密吸取复方白鲜皮抗菌凝胶剂供试品溶液20 ul，按照上述色谱条件分别于0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h进样，测定峰面积，并以峰面积计算RSD值。结果表明，供试品溶液在24 h基本稳定，RSD值为2.54%。

2.3.8重复性实验 精密吸取同一供试品溶液20 μl，依法测定，重复测定5次。结果表明5批样品的白鲜碱含量平均为8.8 μg/g，RSD为1.57%。

2.3.9回收率试验 精密称取复方白鲜皮抗菌凝胶剂3批次样品各1份，每份分别加入白鲜碱对照品溶液适量，制备成高、中、低3个浓度各3份，计算每个浓度的平均加样回收率，平均回收率103.85%，RSD=2.24%（n=3），说明方法回收率良好。

2.3.10样品含量测定 精密吸取供试品溶液20 μl，进样测定，3批样品中白鲜碱的平均含量为8.75 μg/g，结果见表2。

表2　各批号样品含量测定结果（μg/g）

2.4皮肤刺激性试验

2.4.1方法 选用健康家兔4只，体重在4.0～5.0 kg之间，在给药前24 h将兔背部脊柱两侧对称脱毛（每侧大约5 cm×5 cm）。以每只兔子左边为试验组，右边为对照组。每次在背脊右侧涂空白凝胶剂0.3 g，背脊左侧涂含药凝胶剂0.3 g，每日重复给药2次，连续给药1周，观察皮肤变化。

2.4.2实验结果 观察比较对照组和试验组在给药过程中及给药1周内的皮肤情况。结果表明基本无发生皮肤红斑及水肿现象，说明本制剂对皮肤基本无刺激。

2.5稳定性试验

2.5.1离心试验 取凝胶剂样品10 g，装入离心试管中，以2 500 r/min转速离心20 min，结果凝胶剂未出现分层和沉淀现象。

2.5.2耐热试验 取凝胶剂样品10 g，置于60℃恒温水浴放置6 h，结果凝胶剂未出现分层和沉淀现象。

2.5.3耐寒试验 取凝胶剂样品10 g，置于-15℃冰箱放置24 h，结果凝胶剂未出现分层及冻结现象。

2.6抑菌试验

2.6.1悬液定量法 吸取样品凝胶剂原液放入5.0 ml的灭菌试管中，20℃恒温5 min。吸取试验菌液（浓度约为1×104～9×104cfU/ml）0.1 ml加入到凝胶剂样品中，迅速混匀，并立即计时，作用至30 min后，取试验菌与样品混合液1 ml，加入到含5.0 ml经灭菌的PBS试管中，充分混匀。置10 min后，吸取混匀后的样液1 ml，置于灭菌平皿内，每个样液接种两个灭菌平皿。用凉至40℃~45℃的培养基15 ml做倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，当试验菌是金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌时，置37℃恒温箱培养16～18 h；当试验菌是红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏样小孢子菌或犬小孢子菌时，置26℃恒温箱培养7天，做活菌菌落计数；以PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品，实验重复3次，求其平均值。

抑菌率=（对照样品平均菌落数—试验样品平均菌落数）÷对照样品平均菌落数。

悬液定量法结果表明：复方白鲜皮抗菌凝胶剂对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌率均在70%以上。

根据国家标准，抑菌率大于50%的抑菌型制剂属于B2级以上级。说明复方白鲜皮抗菌凝胶剂抑菌试验均达到了国家QBT2850-2005抑菌型制剂抑菌标准。

2.6.2使用前后菌落数比较试验随机选定40名足癣患者志愿受试者。采样者用无菌棉拭子在含有10 ml无菌蒸馏水试管中浸湿，在左脚指屈面从指尖到指根往返涂擦2遍采样，作为使用复方白鲜皮抗菌凝胶剂前对照。用无菌棉拭子蘸取复方白鲜皮抗菌凝胶剂对左脚指屈面从指尖到指根往返涂擦2遍进行擦拭，作用5 min，用无菌棉拭子按上述方法进行采样，作为试验组样本。对所有采样标本经充分振荡洗脱，取洗脱液进行培养和菌落计数，计算自然菌减少对数值。结果表明：使用前志愿受试者脚上平均菌落数为195 cfu/cm2，用复方白鲜皮抗菌凝胶剂后，脚上残存的平均菌落数为55 cfu/cm2，说明用该凝胶剂对皮肤表面自然菌的除菌率为71.8%。

3小结

（1）采用现代提取工艺80%乙醇闪式提取白鲜皮的抗菌成分，与传统的水煎法相比，有提取完全、浓缩方便、药液不易发霉等优点；与回流提取法相比，有提高提取效率、缩短提取时间、减少溶剂使用量等优点。

（2）本研究结合临床和民间治疗手足癣的经验，筛选出治疗手足癣的中药复方制剂。中药白鲜皮多制成洗液或者乳剂进行使用，而制成凝胶制剂的甚少。凝胶剂制备操作简单，生产成本低。

（3）目前市场上个人洗护产品很多，但据调查对手部和足部癣菌有一定治疗作用的护理产品几乎没有。而本制剂能克服西药产生耐药性及有一定毒副作用的弊端，有较好的治疗作用，且安全、方便，能满足消费者追求产品绿色化与安全的消费心理，有产生巨大经济效益的前景。

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[3]张芳芳，张军东，曹永兵，等.天然产物中抗真菌成分研究进展[J].国外医药（植物药分册），2003，18（5）：189.

[4]方和桂.适用于中药外用的剂型——凝胶剂[J].药学专论，2002，11 （8）：25-26.

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[6]李晏，杨延莉，邹豪，等.卡波姆及其在药剂学上的应用[J].解放军药学学报，2008，8（2）：92-93.

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（*通讯作者：汪妍）

R944.1+5

B

1671-1246（2016）13-0094-03

注：本文系2015年浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目（2015R468001）