二氢杨梅素对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

陈璐，周洁，廖宏庆，李国术，钟惠娟，张涛



二氢杨梅素对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

陈璐1，周洁2，廖宏庆3，李国术4，钟惠娟1，张涛3

摘要：目的观察二氢杨梅素（DMY）对鼠源巨噬细胞性泡沫细胞胆固醇流出的影响并探讨其可能机制。方法用50 mg/L的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育鼠源性巨噬细胞RAW264.7经48 h诱导细胞泡沫化。将泡沫细胞分为对照组（只加RPMI 1640的培养基培养）和DMY1～4组（分别用10、20、40和80 μmol/L DMY处理），培养24 h。采用［3H］标记的胆固醇检测细胞胆固醇的流出率，高效液相色谱测定细胞内游离胆固醇（FC）、胆固醇酯（CE）和总胆固醇（TC）的水平，Western blot检测细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达。结果与对照组比较，20、40和80 μmol/L DMY组细胞的胆固醇流出率均显著增加，细胞内FC、TC和CE水平及CE/TC的比值均显著减少，ABCA1的表达显著上调，均呈剂量依赖性（均P＜0.05）。与对照组比较，DMY（10 μmol/L）组细胞胆固醇流出率，细胞内FC、TC和CE水平，ABCA1的表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论DMY促进了鼠源巨噬细胞性泡沫细胞胆固醇流出，其机制可能与上调泡沫细胞中ABCA1的表达有关。

关键词：动脉粥样硬化；泡沫细胞；巨噬细胞；胆固醇；疾病模型，动物；二氢杨梅素；胆固醇流出；三磷酸腺苷结合盒转运体A1

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）是一种二氢黄酮醇类化合物，是民间古茶藤茶中总黄酮的主要成分之一［1］。研究表明，DMY药理作用广泛，具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖和保护肝肾功能等作用［2-3］。最近的研究表明，DMY可降低动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）大鼠的血脂水平，改善其血流动力学，抑制大鼠主动脉弓炎症因子的表达，对AS具有防治作用［4-5］。泡沫细胞胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）障碍是AS形成的重要病理生理学基础［6］。DMY是否通过影响泡沫细胞的RCT而发挥抗AS的作用，目前尚未明确。因此，本研究拟采用氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）孵育鼠源性巨噬细胞建立泡沫细胞模型，观察DMY对泡沫细胞胆固醇流出的影响，并探讨其可能的作用机制，以期为AS的防治提供参考。

1　材料与方法

1.1细胞和试剂RAW264.7鼠源性单核巨噬细胞系购自中国科学院细胞库。DMY购自成都曼斯特生物科技公司。RPMI 1640培养基、小牛血清、胰酶、四乙酸乙二胺购自Invitrogen公司。［3H］标记的胆固醇购自中国原子能研究院同位素研究所。BCA蛋白定量试剂盒购自Invitrogen公司。兔抗小鼠三磷酸腺苷结合盒A1（ATP binding cassette A1，ABCA1）一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国SantaCruz公司。LS 6500型液体闪烁计数仪为美国贝克曼库尔特公司产品。健康人血浆购自广东省广州市中心血站。

1.2巨噬细胞的培养和分组用含10%胎牛血清的RPMI 1640的培养液培养RAW264.7细胞。当细胞的生长融合度达到60%～70%时，加入50 mg/L ox-LDL继续培养48 h，使细胞转化为泡沫细胞。将泡沫细胞分为5组：对照组，用RPMI 1640的培养基培养24 h；DMY1～4组，分别用10、20、40 和80 μmol/L DMY处理泡沫细胞24 h，用于后续的实验。

1.3胆固醇流出率的测定将细胞以3.0×106个/mL接种于6孔板，培养48 h，培养液中含0.2 μCi/L［3H］标记的胆固醇、胎牛血清（体积分数5%）和ox-LDL（50 mg/L）。加入DMY处理24 h后，PBS洗3次，更换培养液为无血清含载脂蛋白A I（50 mg/L）培养液，再培养12 h。培养液和细胞中的［3H］的射线强度用液体闪烁计数仪检测。细胞胆固醇流出率=培养液中［3H］的射线强度/（培养液+细胞）［3H］总的射线强度×100%［7］。

1.4泡沫细胞内胆固醇含量测定采用高效液相色谱分析。处理结束后收集各组细胞，用超声破碎细胞，BCA法测定细胞溶解液的蛋白含量。加入6%三氯醋酸，再加入等体积的正己烷和异丙醇混合液（体积比为4∶1）。搅拌，15℃，2 000×g离心10 min，收集上层的有机相，65℃真空干燥。加入100 μL异丙醇、正庚烷和乙腈的混合液（体积比为35∶13∶52）。室温下，2 000×g离心10 min，收集上清，取10 μL样本用于高效液相色谱分析。高效液相色谱检测中采用C18柱，流动相为异丙醇、正庚烷和乙腈混合液，柱温为4℃，流速为1 mL/min，波长为216 nm，检测时间为10 min。定量胆固醇时以峰面积表示，先测定出游离胆固醇（free cholesterol，FC）和总胆固醇（total cholesterol，TC）的量，胆固醇酯（cholesterol ester，CE）的量=TC的量-FC的量，以mg/g细胞蛋白为测量单位。

1.5Western blot检测ABCA1蛋白的表达水平收集各组细胞，提取细胞的总蛋白，BCA法测量样本的蛋白浓度。取样本50 μg，加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中，煮沸。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白分离。采用转膜仪将蛋白样本转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，丽春红染色观察蛋白转移效果。用10%脱脂奶粉孵育PVDF膜2 h。加入一抗工作液，其中含兔抗鼠ABCA1（1∶200）和β-actin（1∶200）抗体，4℃过夜。TBST液洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，4℃孵育4 h。TBST液洗3次，采用蛋白质印迹荧光检测试剂盒曝光于X线片上，胶片经显影和定影处理后，采用凝胶图像分析系统对胶片进行扫描，以β-actin为内参，通过测量条带灰度值对结果进行半定量分析。实验操作参照文献［8］，实验重复3次。

1.6统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1DMY对泡沫细胞胆固醇流出率的影响对照组、DMY1～4组泡沫细胞胆固醇的流出率（%）分别为14.75±1.37、16.24±1.78、28.39±2.41、36.52±2.15 和44.03±3.61（F=5.79，P＜0.05）。与对照组相比，DMY 2、3和4组以剂量依赖的方式显著增加了泡沫细胞的胆固醇流出率（均P＜0.05）。DMY1组泡沫细胞的胆固醇流出率与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2DMY对泡沫细胞内胆固醇含量的影响与对照组相比，DMY 2、3和4组细胞内TC、FC和CE含量以及CE/TC的比值均降低，呈现剂量依赖性（均P＜0.05）。DMY1组细胞内FC、TC和CE含量以及CE/TC的比值与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab.1　Effects of DMY on the level of cholesterol in foam cells表1　DMY对泡沫细胞胆固醇含量的影响　（n=30，±s）

Tab.1　Effects of DMY on the level of cholesterol in foam cells表1　DMY对泡沫细胞胆固醇含量的影响　（n=30，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与DMY1组比较，c与DMY2组比较，d与DMY3组比较，P＜0.05

组别对照组DMY1组DMY2组DMY3组DMY4组F 525.15±4.73 511.32±45.78 413.73±31.26ab321.69±35.44abc268.76±24.05abcd5.78＊196.75±17.48 195.83±16.44 183.25±14.65ab165.76±18.12abc116.12±8.57abcd4.81＊328.46±35.12 315.49±30.07 228.95±23.08ab156.57±17.34abc121.41±13.08abcd5.29＊62.54±3.81 61.71±4.63 55.34±4.27ab49.57±3.69abc45.17±4.07abcd4.14＊TC（mg/g）FC（mg/g）CE（mg/g）CE/TC（%）

2.3DMY对泡沫细胞ABCA1表达的影响对照组、DMY1～4组ABCA1蛋白的相对表达水平分别为0.11±0.02、0.13±0.03、0.28±0.03、0.37±0.05和0.46± 0.05（n=3，F=6.79，P＜0.05）。与对照组相比，DMY2、3 和4组ABCA1蛋白的表达增加，呈现剂量依赖性（均P＜0.05）。DMY1组ABCA1蛋白的表达与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

Fig.1　Effects of DMY on expression of ABCA1 in foam cells图1　DMY对泡沫细胞ABCA1表达的影响

3　讨论

AS是严重危害人类健康的疾病之一，主要表现为动脉内膜出现脂质沉积，平滑肌细胞向内膜迁移，结缔组织增生，在动脉壁上形成斑块，进而导致血管壁增厚、管腔狭窄和血管弹性降低，如果斑块不稳定且发生破裂即可引发急性临床事件。AS的发病机制非常复杂，涉及饮食、年龄、环境和感染等，至今尚未阐明［9-11］。DMY在我国民间古茶藤茶中含量较高，在葡萄等水果和蔬菜中也自然存在［12］。有研究显示，DMY能抑制大鼠主动脉弓的炎症因子的表达［5-6］。这些研究提示DMY可能具有抗AS的作用，能在AS动物模型中抑制AS的形成。

泡沫细胞形成是AS发生的重要病理生理学基础，在致病因素的刺激下，血液中的单核/巨噬细胞和血管壁中的平滑肌细胞迁移到血管内膜下，吞噬大量被修饰的脂蛋白，导致细胞内脂质代谢紊乱，胆固醇酯大量合成，分解减少，并以脂滴的形式存在［7，13］。DMY是否能够影响AS的主要功能细胞——泡沫细胞中脂质水平和荷脂情况来发挥抗AS的作用，目前尚未明确。细胞内FC、TC和CE含量以及CE/TC的比值是常用来反映细胞荷脂程度或泡沫化程度的指标。本研究结果显示，20、40和80 μmol/L的DMY处理RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后，能以剂量依赖的方式降低泡沫细胞中FC、TC和CE含量以及CE/TC的比值，表明DMY能降低泡沫细胞的泡沫化程度，证实了DMY的抗AS作用。

一般情况下，平滑肌细胞和巨噬细胞能通过吞噬血管内膜下修饰的脂质，从而清除这些脂质，其本身具有积极意义，但是如何将这些摄取的脂质转运出去很关键，而RCT的障碍是AS发病的关键环节。三磷酸腺苷结合盒（ATP-bindingcassette，ABC）转运子超家族是目前已知的最大转运子家族。ABC转运子能够把ATP作为能源，跨膜转运糖类、氨基酸、蛋白质、胆固醇、磷脂、药物和离子等物质［8，14］。经ABCA1转运出的游离胆固醇和磷脂与结合到细胞表面的载脂蛋白A-1结合，形成新生的高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），完成了RCT的第一步，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出。由于ABCA1在RCT和HDL生成中起到了关键作用，因此被称作RCT的“守门人”［15］。研究表明，ABCA1基因突变或基因敲除均可引起AS的发生，而ABCA1的表达水平上调可减少载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）敲除小鼠AS的发生，这表明ABCA1在AS的发生发展中发挥了关键的作用［16］。但是DMY降低泡沫细胞中脂质水平和泡沫化程度，发挥抗AS的作用是否涉及ABCA1尚未明确。本研究显示，20、40和80 μmol/L的DMY显著增加泡沫细胞中胆固醇的流出，显著上调鼠源巨噬细胞性泡沫细胞中ABCA1的表达，提示DMY降低泡沫细胞中脂质水平和泡沫化程度的机制可能与DMY上调泡沫细胞中ABCA1的表达，进而增加泡沫细胞胆固醇的流出有关。然而调控ABCA1表达的机制非常复杂，肝X受体/视黄醇X受体、过氧化物酶体增殖子活化受体和cAMP等信号通路均可参与ABCA1表达的调节。因此，DMY上调ABCA1表达的具体机制还有待进一步研究。

综上所述，DMY促进了鼠源巨噬细胞性泡沫细胞胆固醇的流出，其机制可能与上调泡沫细胞中ABCA1的表达有关。

参考文献

［1］Shen Y，Lindemeyer AK，Gonzalez C，et al.Dihydromyricetin as a novel anti-alcohol intoxication medication［J］.J Neurosci，2012，32 （1）：390-401.doi：10.1523/JNEUROSCI.4639-11.2012.

［2］Hou XL，Tong Q，Wang WQ，et al.Suppression of inflammatory responses by dihydromyricetin，a flavonoid from ampelopsis grossedentata，via inhibiting the activation of NF-κB and MAPK signaling pathways［J］.J Nat Prod，2015，78（7）：1689-1696.doi：10.1021/ acs.jnatprod.5b00275.

［3］Ye L，Wang H，Duncan SE，et al.Antioxidant activities of vine tea （ampelopsis grossedentata）extract and its major component dihydromyricetin in soybean oil and cooked ground beef［J］.Food Chem，2015，172（1）：416-422.doi：10.1016/j.foodchem.2014.09.090.

［4］Liang ZD，Zeng XB，Wei GN，et al.Effect of dihydromyricetin on inflammatory factors and sPLA2-ⅡA mRNA expression of aortic arch in atherosclerosis rats［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2015，21（4）：120-123.［梁柱第，曾宪彪，韦桂宁，等.藤茶双氢杨梅素对动脉粥样硬化大鼠的炎症因子及主动脉弓sPLA2-ⅡA表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（4）：120-123］.doi：10.13422/j.cnki.syfjx.2015040120.

［5］Zeng XB，Wei GN，He F，et al.Effect of total flavonoids of ampelopsis grossedentata on blood lipid and hemorrheology in atherosclerosis rat［J］.Chongqing Medicine，2014，43（5）：518-520.［曾宪彪，韦桂宁，何飞，等.藤茶总黄酮对动脉粥样硬化大鼠血脂及血液流变学的影响［J］.重庆医学，2014，43（5）：518-520］.doi：10.3969/j.issn.1671-8348.2014.05.003.

［6］Zhao LL，Mao YM.High density lipoprotein：the double-edge sword on endothelial function［J］.Tianjin Med J，2015，43（4）：439-442.［赵莉莉，毛用敏.高密度脂蛋白：影响血管内皮功能的双刃剑［J］.天津医药，2015，43（4）：439-442］.doi：10.11958/j. issn.0253-9896.2015.04.029.

［7］Zhong QQ，Zhao SP，Wang X.Effect of high-density lipoprotein on cholesterol efflux in lipopolysacchride stimulated 3T3-L1 adipocytes［J］.Chinese Circulation Journal，2012，27（2）：145-148.［钟巧青，赵水平，王星.高密度脂蛋白对炎症状态下脂肪细胞胆固醇流出的影响［J］.中国循环杂志，2012，27（2）：145-148］.doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2012.02.020.

［8］Bai ZF，Cheng B，Mao XB，et al.Effects of leptin on expression of ACAT-1 during THP-1 differentiation and foam cells formation［J］. Tianjin Med J，2004，32（10）：593-595.［白智峰，成蓓，毛晓波，等.瘦素对THP-1细胞泡沫化过程中ACAT-1表达的影响［J］.天津医药，2004，32（10）：593-595］.doi：10.3969/j.issn.0253-9896.2004.10.001.

［9］WangJ，JiangWM，ZhongY，et al.Effect of Xuezhikangcapsule on the macrophage-derived foam cell formation and the expression of ABAC1 and ABCG1［J］.Med JChin PLA，2014，39（2）：116-120.［王俊，蒋卫民，钟勇，等.血脂康胶囊对巨噬细胞源性泡沫细胞形成以及ABCA1、ABCG1表达的影响［J］.解放军医学杂志，2014，39（2）：116-120］.doi：10.11855/j.issn.0577-7402.2014.02.07.

［10］Zheng XX，Zhou T，Wang XA，et al.Histone deacetylases and atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2015，240（2）：355-366.doi：10.1016/j.atherosclerosis.2014.12.048.

［11］Chen Y，Yuan RY，Li GP，et al.The relationship between ambulatory arterial stiffness index and target organ damage in patients with primary hypertensive［J］.Tianjin Med J，2014，42（5）：477-480.［陈云，袁如玉，李广平，等.动态动脉硬化指数的相关因素及其对靶器官损害的研究［J］.天津医药，2014，42（5）：477-480］.doi：10.3969/j.issn.0253-9896.2014.05.021.

［12］MengG，YangS，Chen Y，et al.Attenuatingeffects of dihydromyricetin on angiotensin II-induced rat cardiomyocyte hypertrophy related to antioxidative activity in aNO-dependent manner［J］.PharmBiol，2015，53（6）：904-912.doi：10.3109/13880209.2014.948635.

［13］Patel KM，Strong A，Tohyama J，et al.Macrophage sortilin promotes LDL uptake，foam cell formation，and atherosclerosis［J］.Circ Res，2015，116（5）：789-796.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.305811.

［14］Gu RX，Corradi V，Singh G，et al.Conformational changes of the antibacterial peptide atp binding cassette transporter McjD revealed by molecular dynamics simulations［J］.Biochemistry，2015，54 （38）：5989-5998.doi：10.1021/acs.biochem.5b00753.

［15］Shao B，Tang C，Sinha A，et al.Humans with atherosclerosis have impaired ABCA1 cholesterol efflux and enhanced high-density lipoprotein oxidation by myeloperoxidase［J］.Circ Res，2014，114（11）：1733-1742.doi：10.1161/CIRCRESAHA.114.303454.

［16］Huang L，Fan B，Ma A，et al.Inhibition of ABCA1 protein degradation promotes HDL cholesterol efflux capacity and RCT and reduces atherosclerosis in mice［J］.J Lipid Res，2015，56（5）：986-997. doi：10.1194/jlr.M054742.

（2015-06-25收稿2015-11-12修回）

（本文编辑陆荣展）

Effects of dihydromyricetin on the cholesterol efflux in macrophage derived foam cells

CHEN Lu1，ZHOU Jie2，LIAO Hongqing3，LI Guoshu4，ZHONG Huijuan1，ZHANG Tao3
1 Department of Internal Cardiology，Liwan Hospital，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510000，China；2 Department of General Surgery，the 169th Hospital of the Chinese People′s Liberation Army；3 Department of Urinary Surgery，the Second Affiliated Hospital，University of South China；4 Department of Emergency，the Central Hospital of Hengyang City Corresponding AuthorE-mail:zhonghuijuanhy@126.com

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of dihydromyricetin（DMY）on the cholesterol efflux in macrophage derived foam cells and analyze the possible mechanisms.MethodsRAW 264.7 macrophages were incubated by oxidized low densi-ty lipoprotein（ox-LDL，50 mg/L）for 48 h to induce foam cells.Subsequently，the foam cells were subdivided into control group（RPMI1640 media）and DMY 1-4 groups（10，20，40 and 80 μmol/L）and cultured for 24 h.Cholesterol efflux from foam cells was examined by［3H］labed cholesterol.The high performance liquid chromatography assay was used to test the cellular contents of free cholesterol（FC），cholesteryl ester（CE）and total cholesterol（TC）.The expression of ATP-binding cassette transporter A1（ABCA1）was measured by Western blot assay.ResultsCompared with control group，cholesterol efflux was significantly increased，the content of FC，TC CE and CE/TC ratio were significantly decreased and expression of ABCA1 was significantly up-regulated in dose dependent manner in DMY（20，40 and 80 μmol/L）groups（P＜0.05）.There were no significant differences in cholesterol efflux，the content of FC，TC and CE，and expression of ABCA1 between control group and DMY（10 μmol/L）group of foam cells（P＞0.05）.ConclusionDMY promotes the cholesterol efflux in the macrophage derived foam cells，which may be related with the increase of ABCA1 induced by DMY.

Key words：atherosclerosis；foam cells；macrophages；cholesterol；disease models，animal；dihydromyricetin；cholesterol efflux；ABCA1

中图分类号：R972.6，R93

文献标志码：A

DOI：10.11958/59120

基金项目：衡阳市科技局课题（2011KJ49）

作者单位：1广州医学院荔湾医院心内科（邮编510000）；2解放军第169医院普外科；3南华大学附属第二医院泌尿外科；4衡阳市中心医院急诊科

作者简介：陈璐（1979），女，本科，主治医师，主要从事动脉粥样硬化性心血管疾病的防治

通讯作者E-mail:zhonghuijuanhy@126.com