响应面法优化乙醇提取牡丹花总黄酮工艺

吴存兵 陈晓兰 吴君艳

摘要：【目的】采用響应面分析法对牡丹花总黄酮提取工艺进行优化，为其开发利用提供技术参考。【方法】以牡丹花为原料，在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C）为影响因素，牡丹花总黄酮提取率（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验设计方法，研究各自变量及其交互作用对牡丹花总黄酮提取率的影响。【结果】牡丹花总黄酮提取率对乙醇体积分数、液料比、提取时间的二次多元回归方程为：Y=5.81+0.29A+0.13B+0.30C+0.24AB+

0.45AC+0.24BC-0.50A2-1.42B2-0.61C2（R2=0.9846），该模型拟合程度较好。其中，乙醇体积分数、提取时间及其二者的交互作用对牡丹花总黄酮提取率有极显著影响（P<0.01），乙醇体积分数与液料比、液料比与提取时间的交互作用对提取率有显著影响（P<0.05）。乙醇提取牡丹花总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数55%、液料比41∶1（mL/g）、提取时间45 min，此条件下牡丹花总黄酮提取率为6.08%，与理论预测值（5.96%）的相对误差为2.01%。【结论】通过响应面建立的牡丹花总黄酮提取工艺模型拟合效果较好，可用于实际预测。优化后的提取工艺具有所需试剂少、提取时间短、易操作等优点。

关键词： 牡丹花总黄酮；乙醇提取；工艺优化；响应面分析

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1370-06

Abstract：【Objective】The extraction process of total flavonoids from peony flower was optimized， in order to provide technical reference for its development and utilization. 【Method】Using peony flower as tested material， the ethanol volume fraction（A）， liquid-solid ratio（B） and extraction time（C） was selected as influencing factor based on single factor experiment， and the extraction rate of total flavonoids（Y） was selected as response value. The effects of all variables and their interactions on extraction rate of total flavonoids from peony flower were investigated through Box-Behnken experiment design method. 【Result】The results showed that， the quadratic multiple regression equation between extraction rate of total flavonoids from peony flower and influencing factors was Y=5.81+0.29A+0.13B+0.30C+0.24AB+0.45AC+0.24BC-

0.50A2-1.42B2-0.61C2（R2=0.9846）， with good fitting degree. Ethanol volume fraction， extraction time and their interaction had extremely significant effects on extraction rate of total flavonoids（P<0.01）. Interaction between ethanol volume fraction and liquid-solid ratio， and interaction between liquid-solid ratio and extraction time had significant effects on extraction rate of total flavonoids（P<0.05）. The optimum extraction conditions of total flavonoids from peony flower was as follows： ethanol volume fraction of 55%， liquid-solid ratio of 41∶1 mL/g and extraction time of 45 min. Under the above optimum conditions， the the extraction rate of total flavonoids from peony flower was 6.08%， the relative error between actual value and predictive value（5.96%） was 2.01%. 【Conclusion】The extraction process model established by response surface methodology shows fitting degree， and can be applied in actual prediction. Furthermore， the optimized extraction process has the advantages of less reagent needed， shorter time， easy operation and so on.

Key words： total flavonoids from peony flower； ethanol extraction； process optimization； response surface analysis

0 引言

【研究意义】牡丹是毛茛科芍药属小灌木，原产于我国长江流域及黄河流域各省的山间或丘陵中，由于其观赏价值和药用价值较高，逐渐由野生变为家养（陈思勤等，2012）。牡丹花含有紫云英苷、没食子酸、苯甲酸等黄酮、多酚类化合物，其中，黄酮类化合物具有降压、降脂、抗骨质疏松、防止动脉硬化、抗衰老等多种保健功效，其花色苷類成分还具有较强的抗氧化活性，可防癌、抗肿瘤（周红林等，2006；吴震生等，2013；袁亚光等，2013）。牡丹花中黄酮类化合物应用前景广阔。因此，研究牡丹花中黄酮类化合物的提取工艺，对其在生物制品、保健品和化妆品等方面的开发应用具有重要意义。【前人研究进展】黄酮是牡丹含有的有效成分之一（高黎明等，2003），从牡丹中提取黄酮类化合物的方法较多，如传统的溶剂萃取法、闪式提取法、酶解法等。王晓等（2005）采用酶法提取牡丹花总黄酮，以0.2 mg/mL纤维素酶和0.1 mg/mL果胶酶为复合酶液，在50 ℃、pH 4.5的条件下酶解120 min，总黄酮产量比传统工艺提高19.8%。刘娟等（2012）采用闪式提取法提取牡丹花粉中黄酮类物质，其最优工艺参数为：乙醇浓度90%、提取时间2 min、料液比1∶25（g/mL）、提取转速4000 r/min，总黄酮提取率为7.8%。冯纪南等（2013）研究超声波辅助提取臭牡丹中黄酮类化合物的工艺，其最佳提取条件为：在超声功率600 W、乙醇浓度50%、料液比1∶40（g/mL）、提取温度60 ℃的条件下超声提取40 min，提取2次，黄酮类化合物基本被提取完全，总提取率为2.653%。吴震生等（2013）采用正交试验优化牡丹花蕊中总黄酮提取工艺，结果表明，以80%乙醇为提取溶剂，在料液比1∶20、超声功率25 kHz的条件下超声提取30 min，得到总黄酮含量为18.85 mg/g。【本研究切入点】目前尚无利用响应面法优化乙醇提取牡丹花黄酮类化合物工艺条件的研究报道。【拟解决的关键问题】选择乙醇体积分数、提取时间、液料比等因素进行牡丹花总黄酮提取工艺单因素试验，以响应面试验设计优化牡丹花总黄酮提取工艺，为其开发应用提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

牡丹花采自淮阴五里农场，采后置于烘箱中80 ℃恒温干燥，再用小型粉磨机将其粉碎，过60目筛后放入广口瓶中密封，避光处常温保存备用。芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等试剂均购自淮安国药化学试剂有限公司。主要仪器设备：725SP紫外可见分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）、80-2型离心沉淀机（北京天创尚邦仪器设备有限公司）、HWS28型电热恒温水浴锅（上海沪粤明科学仪器有限公司）、TP-1200C电子天平（厦门欣锐仪器仪表有限公司）、JJ-2型组织捣碎机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）、JY92-2D超声波细胞粉碎机（武汉爱斯佩科学仪器有限公司）、DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱（上海右一仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 供试品溶液制备 称取一定质量的牡丹花粉末，加入一定体积的乙醇作为提取溶剂，在25 kHz超声波频率下提取一定时间，过滤、洗涤滤渣后合并滤液和洗液，再转入200 mL容量瓶中定容、摇匀，即为供试品溶液。

1. 2. 2 标准曲线绘制 准确吸取0.10 mg/mL芦丁溶液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00和2.40 mL分别置于10.00 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.20 mL，摇匀后静置7 min；然后分别加入10%硝酸铝溶液0.20 mL，摇匀后静置10 min；再分别加入4%氢氧化钠溶液2.00 mL，用80%乙醇稀释定容至10.00 mL，摇匀后静置15 min，用试剂作空白参照试验，在510 nm处测其吸光值，并求出回归方程：A=8.241C-0.0069（R=0.9997），式中，A为吸光值，C为芦丁质量浓度。

1. 2. 3 牡丹花总黄酮含量测定 取供试品溶液0.5 mL，按1.2.2方法处理，于510 nm测定吸光值，再由标准曲线计算总黄酮质量，按公式计算牡丹花总黄酮提取率。

总黄酮提取率（%）=牡丹花中提取总黄酮质量/牡丹花质量×100

1. 2. 4 单因素试验设计

1. 2. 4. 1 乙醇体积分数的确定 在固定液料比30∶1 （mL/g）、提取时间30 min的条件下，考察不同乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%和70%）对牡丹花总黄酮提取率的影响。

1. 2. 4. 2 液料比的确定 在固定乙醇体积分数50%、提取时间30 min的条件下，考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1）对牡丹花总黄酮提取率的影响。

1. 2. 4. 3 提取时间的确定 在固定液料比30∶1（mL/g）、乙醇体积分数50%的条件下，考察不同提取时间（10、20、30、40和50 min）对牡丹花总黄酮提取率的影响。

1. 2. 5 响应面试验设计 根据Box-Benhnken 8.0设计原理，确定中心组合试验的因素与水平。以牡丹花总黄酮提取率为响应值，分别用A、B、C表示乙醇体积分数、液料比、提取时间3个自变量，每个变量的低中高水平分别以-1、0、1进行编码。中心组合设计的因素与水平见表1。

1. 3 统计分析

采用最小显著差数法（LSD）对单因素试验进行比较分析，Box-Benhnken 8.0对响应面试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 乙醇体积分数对牡丹花总黄酮提取率的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，牡丹花总黄酮提取率逐渐提高，当乙醇体积分数为50%时，牡丹花总黄酮提取率最高，乙醇体积分数继续增大，总黄酮提取率呈显著下降趋势（P<0.05，下同）。从节省能源角度考虑，选择50%为单因素试验最佳乙醇体积分数。

2. 1. 2 液料比对牡丹花总黄酮提取率的影响 由图2可知，随着液料比的增加，牡丹花总黄酮提取率逐渐升高；当液料比达40∶1后，继续提高液料比，牡丹花總黄酮提取率略微下降。这是由于提取剂使用量越大，溶液渗透压越大，越有利于牡丹花黄酮类化合物的渗出，且较大提取剂量能够增加牡丹花黄酮类化合物与溶液的接触面积；当液料比达到一定值后，牡丹花黄酮类化合物的提取量趋于稳定，提取剂的继续增加对其影响不明显，且过高的液料比会给后续的浓缩等工作带来一定压力。从节能和效率的角度考虑，选择40∶1为单因素试验最佳液料比。

2. 1. 3 提取时间对牡丹花总黄酮提取率的影响 由图3可知，随着提取时间的延长，牡丹花总黄酮提取率逐渐提高，当提取时间达到40 min时，提取率最高，超过40 min后，提取率变化不显著（P>0.05，下同）。时间过长，不利于工业化生产，因此，选择40 min为单因素试验最佳提取时间。

2. 2 响应面试验结果

2. 2. 1 模型建立及其显著性检验 根据Box-Behnken 8.0设计原理，设计17个处理组合，试验设计及结果见表3。根据表3结果，利用Design-Expert 8.0.6建立牡丹花总黄酮提取率对乙醇体积分数、液料比、提取时间的二次方程模型为：Y=5.81+0.29A+0.13B+0.30C+

0.24AB+0.45AC+0.24BC-0.50A2-1.42B2-0.61C2。

对该模型进行方差分析，结果见表4。由表4可知，模型的F=49.78和P<0.01，表明该模型显著。模型失拟项P=0.2902>0.05，相关系数R2=0.9846>0.8000，即模型失拟项不显著，表明该模型具有极显著的统计学意义。由回归模型系数显著性检验结果可知，该模型一次项A、C和二次项A2、B2、C2极显著（P<0.01，下同），但一次项B不显著。交互项AC对总黄酮提取率的影响极显著，交互项AB、BC对提取率的影响显著。3个因素对牡丹花总黄酮提取率影响的排序为提取时间>乙醇体积分数>液料比。

2. 2. 2 因素交互作用分析 乙醇体积分数、液料比和提取时间3个因素间的交互作用对牡丹花总黄酮提取率影响的三维空间响应面图如图4～图6所示。从响应面的最高点及等高线可以看出，在所选的范围内存在极值，既是响应面的最高点，又是底面上等值线最小椭圆的中心点。

图4显示提取时间与液料比的交互作用对牡丹花总黄酮提取效果的影响，其3D图曲线陡，等高线接近椭圆形，即提取时间与液料比的交互效应显著；图5显示液料比与乙醇体积分数的交互作用对牡丹花总黄酮提取效果的影响，其3D图曲线较陡，等高线椭圆弧度较大，即液料比与乙醇体积分数的交互效应较显著；图6显示提取时间与乙醇体积分数的交互作用对牡丹花总黄酮提取效果的影响，其3D图曲线最陡，等高线椭圆弧度最大，即提取时间与乙醇体积分数的交互效应最显著。这与表4方差分析结果一致。

2. 2. 3 验证试验结果 响应面优化得到的提取工艺条件为：乙醇体积分数55.24%、液料比41.28∶1（mL/g）、提取时间44.58 min，在此条件下，牡丹花总黄酮提取率的预测值为5.96%。为检验响应面法所得结果的可靠性，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：乙醇体积分数55%、液料比41∶1（mL/g）、提取时间45 min，实际测得牡丹花总黄酮提取率为6.08%，与理论预测值相比，其相对误差为2.01%。说明该方程和实际情况比较相符，试验结果充分验证了模型的正确性，响应面法对牡丹花总黄酮提取工艺的优化结果有效。

3 讨论

本研究以牡丹花为原料，通过单因素试验与Box-Behnken 8.0试验设计的响应面试验对牡丹花总黄酮提取工艺条件进行优化，试验模型拟合程度较好，可用此模型对试验进行模拟和预测。响应面优化得到最佳提取工艺为：乙醇体积分数55%、液料比41∶1 （mL/g）、提取时间45 min，在此条件下实际测得牡丹花总黄酮提取率为6.08%，较刘娟等（2012）采用闪式法提取牡丹花粉总黄酮所用乙醇体积分数（90%）低，较冯纪南等（2013）利用超声波辅助提取臭牡丹中黄酮类化合物得到的提取率（2.653%）高，也较李佩艳等（2016）用酶法提取牡丹叶总黄酮所需时间（4 h）短。说明采用响应面法优化牡丹花黄酮类化合物提取工艺具有所需试剂少、提取时间短、易操作等优点。

响应面法不仅能确保理论预测值与试验实际值偏差小，还可分析各影响因素之间的交互作用（吴婧婧等，2014）。本研究考察乙醇体积分数、液料比和提取时间3个因素对牡丹花总黄酮提取率的影响，结果表明，乙醇体积分数、提取时间及其二者的交互作用对牡丹花总黄酮提取率有极显著影响，乙醇体积分数与液料比、液料比与提取时间的交互作用对其有显著影响，与冯纪南等（2013）的研究结果基本一致。

黄酮类化合物具有清除氧自由基、抗氧化、抗菌、抗癌等多种生理和药理活性（周先艳等，2014；李树立和刘玉衡，2015；况伟等，2015），但有关总黄酮清除亚硝酸盐的研究报道较少，如何利用牡丹为总黄酮的工业化生产提供新来源，并开发有效实用的亚硝酸盐天然清除剂有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，采用响应面法优化得到的乙醇提取牡丹花总黄酮工艺具有所需试剂少、提取时间短、易操作等优点，有较高的可行性。

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（責任编辑 罗 丽）