基于溶藻效果的溶藻细菌A21培养基成分优化

李文利++傅以钢++刘征宇++章忠辉++陆雅雅

摘要：蓝藻“水华”的暴发对人体健康、水产养殖等造成了严重影响，微生物法是一种安全、有效的水华防治方法。通过碳源及氮源的单因素试验、Plackett-Burman试验设计、响应面试验分析对A21菌株的培养基进行优化，最佳培养基配方为蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。该培养基使A21菌株对铜绿微囊藻的叶绿素a（叶绿素a）清除效率提高了5.18%。

关键词：蓝藻；溶藻细菌；培养基；优化；Plackett-Burman试验；响应面分析

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0516-05

收稿日期：2015-04-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：21277101）；上海海洋大学横向课题（编号：D-8006-13-0117）。

作者简介：李文利（1988—），女，江苏徐州人，硕士，主要从事食品微生物研究。E-mail：1067349333@qq.com。

通信作者：李晓晖，博士，副教授，主要从事食品生物技术研究。E-mail：xhli@shou.edu.cn。

人为因素导致太湖水体富营养化进程加速，于2007年暴发了大规模“水华”，给当地居民带来了恐慌[1]。近年来的监测结果显示，60%太湖水域的营养化水平处于中度污染以上，东莱水系等甚至达到重度污染，其余水域均为轻度污染[2-4]。微囊藻是太湖蓝藻“水华”的优势藻类，铜绿微囊藻（Microcstis aeruginosa）是其代表藻株，其细胞内含有多种色素蛋白，生长速度极快，并产生对人体有害的微囊藻毒素[5-6]。水体富营养化水平持续偏高带来的“水华”现象令人堪忧，寻求一种高效、环保的抑藻物质迫在眉睫。

从“水华”暴发水体中分离安全、有效的溶藻细菌是一种有效的防治手段和途径，为水污染治理提供了新的研究思路[7-9]。现已报道多株分离自太湖水域的溶藻细菌，为抑制蓝藻“水华”现象提供了良好基础，但大多处于分离鉴定阶段，对于抑藻物质制备成本高、生物活性低且不稳定、二次污染等生物安全性问题尚有待进一步研究，以期实现溶藻微生物在治理“水华”中的应用[10]。

本研究通过优化溶藻菌株A21的培养基成分，提高对M. aeruginosa 905生物量的清除率。在单因素试验的基础上进行Plackett-Burman（PB）设计，选择出溶藻菌株A21溶藻效果的主要影响成分；根据PB试验结果进行响应面试验设计（response surface methodology，RSM），建立预估模型，得到估算的最佳培养基配方；根据实际情况进行调整，得到溶藻菌株A21的最佳培养基配方。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1藻种和菌种

铜绿微囊藻905（M. aeruginosa 905）购自中国科学院水生生物种质库淡水藻种库，转接至新鲜的BG11培养基中，于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h条件下培养[11]。溶藻菌株A21由笔者所在实验室利用原位取样法[12]从太湖暴发蓝藻“水华”的水域分离得到，经鉴定为芽孢杆菌属。

1.1.2主要试剂

溶藻菌株A21的基础培养基成分为碳源5 g/L、氮源10 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L，采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH将pH值调至70。营养琼脂和营养肉汤用于A21菌株的活化和培养；鲁格氏碘液用于藻细胞固定；丙酮用于铜绿微囊藻细胞叶绿素的提取。

1.1.3主要仪器

SPX-250PG型智能型光照培养箱（上海天恒医疗机械有限公司），SQ-UV2300型紫外可见分光光度计（北京宇艾奇电子科技有限公司），CX21型光学显微镜（OLYMPUS 奥林巴斯），藻类计数框（新科仪器，计数区 20 mm×20 mm，100个小格），TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机（湘潭湘仪仪器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1溶藻试验

A21菌株经营养琼脂活化后接种在新鲜的基础培养基中，于37 ℃、180 r/min条件下培养12 h。将菌液以4 000 r/min离心10 min，取0.5 mL上清液与4.5 mL生长对數期的M. aeruginosa 905藻液进行混合，同时取0.5 mL灭菌的基础培养液与4.5 mL生长对数期的M. aeruginosa 905藻液混合作为对照组，置于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h条件下培养5 d。

1.2.2碳源和氮源的单因素选择

根据微生物营养代谢方式的不同，选择可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、乙酸钠等为碳源，选择硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素为氮源。采用不同的碳源、氮源分别培养菌株A21后进行溶藻试验。

1.2.3Plackett-Burman设计变量

采用Mintab 16软件进行Plackett-Burman（PB）设计，对影响A21菌株生长的9个培养基成分进行考察，即碳源、氮源、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培养基初始pH值。每个因素取高水平和低水平2个水平，高水平为低水平的1.5倍。另设X4、X8、X12为虚拟列，在试验中为空，以考察试验误差。以叶绿素a清除率（%）为响应值，设定3个平行试验，试验设计见表1。

1.2.4响应面试验设计在Plackett-Burman试验的基础上确定响应面分析的因素与水平，采用Box-Behnken中心组合设计4因素3水平共29个试验点进行试验。优化A21菌株的培养基成分，并在最佳培养基成分配比下对铜绿微囊藻叶绿素a清除率进行3次平行试验，证实响应面分析法的可靠性。

1.2.5M. aeruginosa 905生物量指标叶绿素a浓度的测定在超声条件下使M. aeruginosa 905藻细胞破碎并释放出叶绿素a，利用丙酮于低温黑暗条件下萃取12 h后离心，分别于630、647、664、750 nm下测定上清液的吸光度[11-13]。根据公式（1）计算叶绿素a含量：

C（mg/L）=11.85（D664 nm- D750 nm）-1.54（D647 nm- D750 nm）-008（D630 nm- D750 nm）。[JY]（1）

式中，D664 nm、D647 nm、D630 nm、D750 nm分别表示波长为664、647、630、750 nm 时提取液的吸光度。

根据公式（2）计算A21菌株的叶绿素a清除率（A）：

[JZ（]A=（1-Dt/Dc）×100%。[JZ）][JY]（2）

式中，Dt（mg/L）、Dc（mg/L）分别为试验组、对照组的叶绿素a浓度。

1.2.6数据处理利用Mintab 16、Design-expert 8.0、Excel 2010软件对试验数据进行分析处理。

2结果与分析

2.1碳源及氮源的选择结果

将A21菌株接种于营养肉汤中，于37 ℃下培养12 h，离心去除菌体后与铜绿微囊藻液混合，5 d后溶藻试验结果见图1。可见其溶藻能力较好，经计算得到叶绿素a清除率为80.34%。

[FK（W10][TPLWL1.tif]

以蛋白胨为氮源选择不同碳源，其他成分与基础培养基一致，试验结果见图2。以蔗糖为碳源选择不同氮源，其他成分与基础培养基一致，试验结果见图3。以蔗糖为碳源时，A21菌株对叶绿素a的清除率最高，为79.21%；以酵母膏为氮源时，A21菌株对叶绿素a的清除率最高，为81.27%。

2.2Plackett-Burman试验设计结果

利用Mintab 16软件进行Plackett-Burman设计，对影响

[TPLWL2.tif]

A21菌株生长的9个培养基成分进行考察，即蔗糖、酵母膏、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養基初始pH值。在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman设计创建试验次数n=20的试验，对12个因素（9个实际因素、3个虚拟因素）进行考察。每个因素取高水平和低水平2个水平，以叶绿素a清除率（%）为响应值，试验设计及试验结果见表2。利用Mintab 16软件对试验结果进行分析（表3、图4），可见培养基中蔗糖、酵母膏、磷酸钾、初始pH

[TPLWL3.tif]

值对菌株A21的溶藻效果影响显著（P<0.05）。R2为9433%，R2（预测）为95.34%，表明该结果的可信度较高。

2.3响应面试验设计与结果

在PB试验设计的基础上确定4个主要影响因素，根据Box-Behnken中心组合设计原理，利用Design-Export 8.0软件对蔗糖、酵母膏、磷酸钾、初始pH值进行4因素3水平的响应面分析试验，试验设计与结果见表4、表5。

该响应面试验设置4个中心点，共有29个处理，重复3次以评估试验误差。采用Design-Export 8.0数据处理软件

对表6中的数据进行二次多元回归拟合，以叶绿素a清除率（Y，%）为因变量，以蔗糖（X1，g）、酵母膏（X2，g）、磷酸钾（X3，g）、[JP2]初始pH值（X4）为自变量建立回归方程。根据表6中各因素的P值去除回归方程中影响不显著的因子，对二次回归方程进行优化得到回归方程：Y=80.485 2+0.572 5X1+2.096 7X2-2.245X3+0.412 5X4+1.22X1X2-1.302 5X1X3+2.47X2X3+1.315X2X4-1.667 5X3X4-5.839 75X12-2753 5X22。

由表6、表7可知，A21菌株培养基成分优化回归模型的P值<0.000 1，失拟的P值为0.508 1，表明回归模型高度显著（P<0.05），失拟检验不显著（P>0.05）。桑叶黄A21菌株培养基成分优化回归模型的校正确定系数R2为0.948 6，表明模型能解释约94.86%响应值的变化，仅有5.14%的总变异不能用该模型解释。确定系数R2为0.974 3，表明模型拟合程度良好、试验误差小，该回归模型可用来分析和预测A21菌株培养基成分优化的情况。

响应面3D图和等高线（图5）可直观反映各因素间的交互作用及其强弱[14-15]。

2.4最佳培养基配方与验证试验

采用Design-Expert V8.0.6软件预测A21菌株的最佳培养基配方为蔗糖6.475 g/L、酵母膏13.025 g/L、磷酸钾 0.5 g/L、pH值8.2，此时A21菌株培养液的叶绿素a清除效率为85153 4%。根据实际情况进行调整，最佳试验配方为蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。进行多次验证试验，菌株A21培养液的叶绿素a清除效率为84.5%，相对误差为07%。通过对培养基成分的优化，菌株A21的叶绿素a清除效率提高了518%。

3结论

菌株A21是一株高效、安全的溶藻细菌，细菌中的某些代谢产物可促使藻细胞死亡。为进一步提高菌株A21的溶藻能力，通过碳源和氮源的单因素选择试验、PB试验设计、响应面试验设计对菌株A21的培养基成分和配比进行研究，得到该菌株的最佳培养基配方，其叶绿素a清除效率由8034%提高至84.50%。[CM（21*2/3]本研究结果为菌株A21及其发酵产物在蓝藻“水华”治理中的应用提供依据。

参考文献：

[1]Ding L，Wu J Q，Pang Y，et al. Simulation study on algal dynamics based on ecological flume experiment in Taihu Lake，China[J]. Ecological Engineering，2007，31（3）：200-206.

[2]李娟英，曹宏宇，崔昱，等. 太湖流域主要水系水环境特征分析与富营养化评价[J]. 水生态学杂志，2012，33（4）：7-13.

[3]钱益春，何平.1998—2006年太湖水质变化分析[J]. 江西农业大学学报，2009，31（2）：370-374.

[4]Chen Y，Qin B，Teubner K，et al. Long-term dynamics of phytoplankton assemblages：Microcystis domination in Lake Taihu，a large shallow lake in China[J]. Journal of Plankton Research，2003，25（4）：445-453.

[5]陳水勇，吴振明，俞伟波，等. 水体富营养化的形成、危害和防治[J]. 环境科学与技术，1999，2（2）：12-16.

[6]孔繁翔，高光. 大型浅水富营养化湖泊中蓝藻水华形成机理的思考[J]. 生态学报，2005，25（3）：589-595.

[7]Imamura N，Motoike I，Shimada N，et al. An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem[J]. Journal of Antibiotics，2001，54（7）：582-587.

[8]van Hannen E J，Zwart G，van Agterveld M P，et al. Changes in bacterial and eukaryotic community structure after mass lysis of filamentous cyanobacteria associated with viruses[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（2）：795-801.

[9]赵传鹏. 环境溶藻细菌的检测与评价[D]. 南京：东南大学，2005.

[10]倪兆林，申元英. 溶藻类细菌的研究现状[J]. 现代生物医学进展，2013，13（15）：2997-3000.

[11]Shao J H，Li R H，Joe E L，et al. Potential for control of harmful cyanobacterial blooms using biologically derived substances：problems and prospects[J]. Journal of Environmental Management，2013，125（1）：149-155.

[12]Hu X，Liu Y G，Zeng G M，et al. Effects of limonene stress on the growth of and microcystin release by the fr-eshwater cyanobacterium Microcystis aeruginosa FACHB-905[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2014，105（1）：121-127.

[13]安鑫龙，李豫红，赵艳珍，等. 溶藻微生物的研究方法[J]. 水利渔业，2005，25（2）：17-18.

[14]周得庆，徐士菊. 微生物学[M]. 北京：化学工业出版社，2007：134-142.

[15]Tahmouzi S. Optimization of polysaccharides from Zagros oak leaf using RSM：antioxidant and antimicrobial activities[J]. Carbohydrate polymers，2014，106：238-246.

[16]姜绍通，汪洪普，潘丽军. 响应面法优化微波辅助提取芋头多糖工艺研究[J]. 食品工业科技，2013，34（3）：215-219.