响应面微波辅助提取金花茶花多糖工艺研究

刘茜+许子竞+胡旭飞

摘 要 为优化金花茶花中水溶性多糖微波提取工艺，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法建立了金花茶花多糖（CCFP）微波提取的二次响应曲面方程.试验的三因素（温度、时间和液料比）对CCFP提取有不同的影响.结果表明，在试验范围内，通过方差分析得出，微波提取温度对CCFP影响最大，其次为提取时间，液料比对CCFP提取率影响最小.试验因素的最佳条件为：提取温度77 ℃，时间10 min，液料比为26 mL∶1 g.在此条件下，CCFP提取率可达3.40%，与模型预测值3.56%很接近.

关键词 金花茶花；微波辅助浸提；多糖；响应面分析

中图分类号 O629 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2016）03-0040-06

Abstract In order to optimize the conditions of microwave-assisted extraction method of polysaccharides from Camellia Chrysantha （Hu） Tuyama flowers（ CCFP）， an equation for the microwave extraction was obtained on the basis of single-factor experiments. Our results show that the extraction temperature， extraction time and solvent to material ratio have different effects on the yield of CCFP. Our study indicates that the order of importance of these factors affecting on the extraction yield is as follows： microwave treatment temperature， microwave treatment time and solvent to material ratio. The optimal condition of the microwave extraction of CCFP is at 77 ℃ for 10 min with 1∶26（g/mL） as the solvent to material ratio. The extraction rate of CCFP can be up to 3.40%， agreeing well with the predicted value of 3.56%.

Key words Camellia chrysantha （Hu） Tuyama flowers； microwave-assisted extraction technology； polysaccharides； response surface analysis

山茶科山茶属的金花茶（Camellia chrysantha （Hu） Tuyama）为常绿灌木至小乔木，是我国珍稀濒危植物，其叶为深绿色，皮灰黄色，花蜡质金黄，金瓣玉蕊，耀眼夺目，晶莹而油润，呈杯状、壶状或碗状，有“植物界大熊猫”、“茶族皇后”之美称，国外则称之为“幻想中的黄色山茶花”，仅分布于我国广西的西南部[1-2].金花茶的药用在《本草纲目》中有记载，在广西壮族民间是一种传统中草药， 临床实验研究表明，金花茶花水提物可降血压、降血脂、降低胆固醇，可在某种程度上抑制转移性恶性肿瘤的生长，防止动脉粥样硬化等[3-4].药理研究也指出，表现金花茶生理活性的重要组成部分是其所含的多糖[5-7]，对于金花茶花多糖（Camellia chrysantha（Hu） Tuyama flowers polysaccharide（CCFP））的提取工艺研究，目前国内外未见报道.

微波辅助提取具有快速、简单、安全、低耗等优点，被广泛用于植物有效成分的提取.本实验采用微波辅助提取CCFP[8-9]. 在单因素实验的基础上，利用响应面分析法建立回归方程，计算出影响因子与影响因子、影响因子与指标（花多糖提取率）之间的相互关系，根据得出的结果优化CCFP提取工艺条件.

1 材料与方法

1.1 实验试剂、材料及仪器

金花茶花由广西合浦佳永金花茶开发有限公司提供；丙酮、无水乙醇、甲醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚等均为分析纯.

微波提取器（广州兴兴微波能技术有限公司），2102PCS紫外-可见分光光度计（尤尼科（上海）仪器有限公司），FD-1-80冷冻真空干燥器（北京博医康实验仪器有限公司），RE-52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化有限公司）， DLSD-500低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司），AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），KA-1000台式离心机（上海安亭科学仪器厂）.

1.2 试验方法

1.2.1 CCFP的提取工艺流程 金花茶花→阴干→粉碎→无水乙醇、丙酮脱除蜡脂→烘干→粉碎过0.282 mm（50目）筛→称重→微波提取3次→合并滤液→减压浓缩到体积1/5 →离心→取上清液→Sevag法脱蛋白→减压浓缩后加乙醇至含醇80%→于4 ℃冰箱过夜静置→离心→沉淀物用无水乙醇、丙酮洗涤→冷冻干燥→CCFP.

1.2.2 CCFP含量及提取率测定 采用苯酚-硫酸法测多糖：以葡萄糖为标准品（采用0.9的系数校正），测定总糖含量，再采用DNS法测定还原糖含量[10].CCFP含量=总糖含量-还原糖含量；CCFP提取率=[多糖干品质量（g）/原料质量（g）] × 100%.

1.2.3 单因素试验 CCFP的提取率主要受微波提取时间、温度和液料比3个因素影响.试验在固定微波功率（600 W）下进行，考察不同的液料比、提取温度、提取时间对CCFP提取率的影响.

1.2.4 CCFP最优提取工艺的设计与试验 以1.2.3单因素实验结果为基础，根据Benhnken中心组合试验设计原理，确定响应面分析法所建立的二次响应曲面方程的3个自变量[11]：提取时间（Z1）、提取温度（Z2）、液料比（Z3），以提取率（Y）为响应值，试验因素与水平设计见表1.通过响应曲面分析（response surface analysis， RSA）得出最佳的提取条件[12-14]，根据优化条件进行3次平行实验，取3次实验所得提取率的平均值，并与理论预测值比较.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 微波提取时间对CCFP提取率的影响 把预处理原料固定液料比25 mL∶1 g，提取温度75 ℃，改变提取时间进行实验研究，考察微波提取时间对CCFP得率的影响.从图1可知，CCFP提取率随提取时间的延长发生变化，当微波提取时间增至10 min时，提取率达到最大值，随着提取时间延长，提取率无明显提高，综合考虑CCFP的提取率和功效关系，确定试验的最佳提取时间为10 min.

2.1.2 提取温度对CCFP提取率的影响 把预处理的原料固定液料比为25 mL∶1 g，提取时间为10 min，改变提取温度进行实验研究，考察温度与CCFP提取率的关系.如图2所示，在75 ℃之前， CCFP的提取率几乎与温度成线性关系，在温度上升到80 ℃以后，CCFP提取得率略有减少，可能是温度低于80 ℃时，微波对多糖的结构与活性破坏较小，而较高温度时微波对多糖结构有影响.故确定试验的提取温度为75 ℃.

2.1.3 液料比对CCFP提取率的影响 把预处理原料固定提取温度75 ℃，时间10 min，以不同的液料比进行实验研究，研究液料比对CCFP提取率的影响.如图3所示，随着液料比的增加，CCFP提取率提高明显，这是因为增加提取溶剂，对CCFP有稀释的效果，但当液料比达到25 mL∶1 g后，这种效果不明显，而随着液料比增加反而会影响后续的工作，故确定试验的液料比为25 mL∶1 g.

2.2 响应曲面法优化CCFP的提取工艺条件

2.2.1 响应曲面分析方案与结果研究 在单因素试验的基础上，通过Design-expert 8.2软件程序，采用提取温度、时间和液料比三因素和三水平SAS的分析方法，通过二次响应曲面分析，对CCFP提取的微波条件进行优化.

对时间（Z1）、温度（Z2）和 液料比（Z3）作如下变换：设X1=（Z1-10）/2， X2=（ Z2-75）/10， X3=（ Z3-25）/5，以因素X1，X2，X3作自变量，CCFP的提取率为响应值（Y），试验方案及相应结果如表2所示.

对该模型进行方差分析，结果见表3.根据上述回归方程作出响应曲面和等高线图，如图4～6所示.等高线的形状反映出两交互因素效应的大小，椭圆形表示两交互因素作用强，而圆形则相反.

从表3可知，方程的F=30.776 3>F0.01（9.3），模型P<0.01， 表明该二次回归方程极显著，而失拟项不显著（P=0.279 0>0.05）.模型R2=0.950 4（校正系数），说明方程的拟合状况良好，可用该模型解释9504%的响应值的变化.复相关系数为98.23，说明该模型拟合度较好.一次项X2，二次项X21和X22的P<0.01说明其对CCFP得率的响应曲面影响极为显著，一次项X1为显著因素（P<0.05）， 而交叉项X1X2，X1X3，X2X3影响不显著（P>0.05），表明3个影响因素之间的交互效应影响小.通过对F值的检验可知，试验3个因素对CCFP提取率影响的顺序为：X2>X1>X3.从典型分析表（表4）可知，3个因素的特征值全为正，表明该模型稳定点为提取最佳值.

从表4可知，三条件的X值为：X1=0.141 8，X2=0.178 3，X3=0.161 4，根据公式（X优-X中）/X间=X值求得，该方法的优化工艺条件为：Z1=10.283 6 min，Z2=76.783 ℃，Z3=25.807∶1， 即微波辅助提取金花茶花多糖的最优工艺条件为：提取时间10 min，提取温度 77 ℃，液料比26 mL∶1 g.用此工艺参数进行3次平行实验，实际提取率的平均值为3.40%，而在此条件下，提取率的理论值为3.56%，实际得率与理论预测得率仅差0.16%，说明回归模型具有较高的可靠性.

3 结论

以金花茶花粉末为原料，水为溶媒，借助微波辅助提取CCFP，效率快，温度低，提取率高，适宜于金花茶花中的多糖及热敏性成分提取.利用响应面对CCFP的提取工艺进行优化，得最佳条件为：温度77 ℃，时间10 min和液料比26 mL∶1 g.在此条件下，CCFP提取率理论值为3.56%，实际提取率可达3.40%.

参考文献：

[1] 韦 霄，蒋运生，韦记青，等.珍稀濒危植物金花茶地理分布与生境调查研究[J].生态环境， 2007，16（1）：895-899.

[2] YANG Q H， XIAO W， ZENG X L， et al. Seed biology and germination ecophysiology of camellia nitidissima[J]. For Ecol Manage， 2008，225（1）：113-118.

[3] 陈永欣，吕淑娟，韦锦斌.金花茶化学成分和药理作用研究进展[J].广西中医药， 2013，36（1）：4-5.

[4] 赵元华，刘会芳，何荣霞.金花茶抗肿瘤作用的研究进展[J].医学综述， 2015，21（16）：2995-2997.

[5] 田晓春，秦小明，林华娟，等.金花茶多糖理化性质的研究[J].中国食品学报， 2011，11（8）：47-52.

[6] 沈 洁，张可锋，朱 华.金花茶的化学成分及其药理作用的研究进展[J].内蒙古中医药， 2011，30（2）：121-122.

[7] 韦 霄，黄兴贤，蒋运生.3种金花茶组植物提取物的抗氧化活性比较[J].中国中药杂志， 2011，36（5）：639-640.

[8] 卫 强，江敦清，纪小影，等.微波辅助提取垂丝海棠花中多糖及其抗氧化研究[J].食品工业技术， 2014，36（3）：137-141.

[9] HAN S C， WING N L，YI X X. An Acidic polysaccharide from tribulus terrestris[J]. Chin Chem Lett， 2002，13（7）：625-628.

[10] 张维杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社， 1994：13-16.

[11] BOX G E， HUNTER W G. Statistics for experiments： an introduction to design data analysis and model building[M]. New York：Wiley，1990.

[12] 张乔会，逄锦慧，杨 喆，等. 响应面法优化杜香多糖提取工艺[J].天然产物研究与开发， 2015，27（6）：1105-1108.

[13] 马艳弘，刘 晨，张宏志，等.响应面法优化芦荟皮多糖的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究[J].江西农业大学学报（自然科学版）， 2015，37（1）：149-156.

[14] 许子竞，黎贵卿，黄 丽，等.金花茶叶多糖微波辅助提取工艺优化和含量测定[J].食品科学， 2010，31（4）：53-58.

（编辑 WJ）