云南产地参多糖脱色、脱蛋白及其抗凝血活性研究

李岩 张翠香 罗永会

摘 要：以地参多糖损失率、蛋白去除率和色素去除率为测定指标，筛选地参多糖脱蛋白、脱色的最佳方法，并对精制总多糖的抗凝血活性进行了研究，结果表明，4种多糖脱蛋白方法中，效果最好的为三氯乙酸-正丁醇法，经该方法处理的地参多糖提取液，蛋白质去除率为（80.28±0.98）%，多糖损失率为（9.67±0.97）%；活性炭脱色法为地参多糖的最佳脱色方法，用终浓度为1%的活性碳对地参多糖水溶液进行脱色，脱色率达到（91.56±0.87）%，多糖损失率为（8.39±0.74）%。抗凝血试验表明，地参多糖具有明显的体外抗凝血活性，能延长人体血浆APTT（活化部分凝血活酶时间）与PT（凝血酶原时间），对TT（凝血酶时间）无影响。实验结果可为地参多糖纯化及活性的研究提供基础。

关键词：地参；地参多糖；脱色；脱蛋白；抗凝血

中图分类号 S567.23 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0013-04

Abstract：With the loss rate of polysaccharide，protein removal rate and pigmentation removal rate of L. lucidus Turcz as indicators，the best method of deproteinization and decolorization of L. lucidus Turcz polysaccharide was screened. The anticoagulant activity of refined polysaccharides was also studied. The results showed that the best method for protein removal was trichloroacetic acid-n-butanol method. The protein removal rate and polysaccharide loss rate of polysaccharide extract from L. lucidus Turcz were（80.28±0.98）% and（9.67±0.97）% respectively. Activated carbon decolorization is the best decolorization method for polysaccharides from L. lucidus Turcz. The decolorization rate of Polysaccharides from L. lucidus Turcz was（91.56±0.87）% and the loss rate of polysaccharides was（8.39±0.74）% with 1% active carbon at the final concentration. Anticoagulation test showed that L.lucidus Turcz polysaccharides had obvious anticoagulant activity in vitro. L. lucidus Turcz polysaccharides could prolong APTT （activated partial thromboplastin time） and PT （prothrombin time） in human plasma，but had no effect on TT （thrombin time）. The test was expected to provide a basis for the purification and activity of Polysaccharides from L. lucidus Turcz.

Key words：L. lucidus Turcz；L. lucidus Turcz Polysaccharides；Decoloration；Deproteinization；Anticoagulation

多糖廣泛存在于动物、植物和微生物细胞中，研究表明，多糖具有抗肿瘤、降血糖、增强人体免疫力以及抗病毒等多种生物活性[1-5]。近年来，血栓性疾病日益威胁着人们的身体健康[6]。抗凝血药物如肝素多糖在血栓性疾病的治疗中起着重要作用，但副作用则是易引起自发性出血及血小板减少[7]。因此，寻找天然抗凝血活性产物，进而研发新药，开发功能性食品，具有毒性小、费用低的优势[8]。

地参（L. lucidus Turcz.）又名虫草参、银条菜，为唇形科属多年生草本植物，食药兼用，在我国主要产于云南、广西。地参含有多种药用成分，其茎叶晒干后即是名贵中草药。全草入药，具有活血、利尿、通经、滋阳、润燥、调血脂、通窍、利关节、养气血等功能。目前，植物多糖的提取通常采取水提醇沉的方法，得到的多糖产品纯度较低，主要杂质有色素、蛋白质和一些小分子物质。色素的存在不仅影响多糖的色泽，同时也影响多糖的纯度，从而影响其生物活性，阻碍了对多糖的组成及结构以及生物活性关系的研究[9，10]。目前，对太子参、西洋参等植物多糖的提取工艺的研究已有报道[11，12]，而对地参多糖提取工艺的研究还鲜有报道[13]，其除蛋白脱色工艺及抗凝血活性的研究尚未见报道。为此，本研究对不同脱色和脱蛋白方法的效果进行了比较，筛选地参多糖脱蛋白、脱色的最佳方法，使粗多糖得到精制，并对精制多糖的抗凝血活性进行了研究，为地参的综合利用提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 地参购于大理市剑川县农贸市场。葡萄糖对照品、牛血清白蛋白为北京奥博星生物技术有限责任公司进口分装；考马斯亮蓝G-250为北京鼎国生物技术有限公司进口分装；其他试剂均为分析纯。试验使用的仪器主要有：RE-25B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），B600型低速自动平衡离心机（上海医用分析仪器厂），SH-2型磁力搅拌器（北京洪博达科技有限公司），BT-224S型电子分析天平（德国赛多利斯仪器公司），FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司），UV2550型紫外分光光度计（日本岛津苏州仪器有限公司），恒温水浴锅（上海博迅达实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 地参多糖提取工艺流程 地参干料→粉碎→脱酯（5倍体积无水乙醇，70℃回流2次，每次2.5h）→加水浸提→离心→浓缩→乙醇沉淀→离心→沉淀60℃恒温干燥→地参多糖粗品，具体提取方法参照文献[13]进行。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 多糖含量测定 标准曲线的绘制：精确称取已经干燥至恒重的葡萄糖标准品24mg，用500mL蒸馏水定容至刻度，分别吸取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，然后加入5%苯酚水溶液0.5mL，再沿着试管壁缓慢滴入浓硫酸至总体积达10mL，用快速旋涡混匀器混合均匀后，室温放置30min，在波长490nm处测定吸光度。样品测定：吸取样品液1.0mL按上述步骤操作，测定吸光度，以标准曲线计算多糖含量[14]。

1.2.2.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝G-250染色法[15]。

1.2.2.3 多糖损失率测定 多糖损失率的计算为：

[多糖损失率（%）=C1-C2C1×100]

式中：C1为脱蛋白或脱色前多糖的质量浓度；C2为脱蛋白或脱色后多糖的质量浓度。

1.2.2.4 色素去除率测定 地参多糖脱色效果的评价用“脱色率”表示：

[脱色率（%）=A1-A2A1×100]

式中：A1为脱色前吸光度；A2为脱色后吸光度值。

1.2.2.5 蛋白脱除率的测定 地参多糖水溶液中蛋白脱除效果的评价用“蛋白脱除率”表示：

[蛋白脱除率（%）=M1-M2M1×100]

式中：M1为脱蛋白前多糖溶液中蛋白质的质量浓度；M2为脱蛋白后多糖溶液中蛋白质的质量浓度。

1.2.2.6 检测波长的测定 对地参多糖的水溶液于200～700nm波长范围内进行全波长扫描，检测其最适吸收波长。

1.2.3 地参多糖脱色方法 脱色前后的多糖溶液于最适吸收波长下，测定多糖溶液的吸光度值，计算色素去除率，以多糖损失率为指标，考察不同浓度的活性炭、H2O2对多糖的脱色效果。

1.2.3.1 过氧化氢脱色 取粗多糖溶液（0.5mg/mL），加入适量30%的过氧化氢，使过氧化氢在多糖溶液中的终浓度分别为0.5%、1%、1.5%，搅拌0.5h，8000r/min离心10min，收集上清液，测定上清液吸光度值和多糖含量，计算色素去除率和多糖损失率。

1.2.3.2 活性炭脱色 取粗多糖溶液（0.5mg/mL），加入经重蒸水清洗过滤，110℃干燥至恒重的活性炭，使活性碳在多糖溶液中的终浓度分别为0.5%、1%、1.5%，搅拌0.5h，8000r/min离心10min，收集上清液，测定上清液吸光度值和多糖含量，计算色素去除率和多糖损失率。

1.2.4 地参多糖脱蛋白方法 采用水提醇沉法所得的多糖中常存在一定量的蛋白质。蛋白质的存在会对多糖生物学活性产生影响。为得到高纯度多糖精制品。本研究以蛋白去除率、多糖损失率为指标，比较三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sveage法的脱蛋白效果，筛选出地参多糖最佳脱蛋白方法。

1.2.4.1 三氯乙酸法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，

加入等体积20%三氯乙酸，搅拌1.5h，静置过夜，8000r/min离心10min，收集上清液，测定蛋白和多糖含量，计算蛋白去除率和多糖损失率。

1.2.4.2 三氯乙酸-Sevage法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，加入等體积10%三氯乙酸和10mL Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），搅拌1.5h，8000r/min离心10min，收集上清液，测定蛋白和多糖含量，计算蛋白去除率和多糖损失率。

1.2.4.3 三氯乙酸-正丁醇法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，加入100mL三氯乙酸-正丁醇（三氯乙酸∶正丁醇=1∶10）试剂，搅拌1.5h，8000r/min离心10min，收集上清液，测定蛋白和多糖含量，计算蛋白去除率和多糖损失率。

1.2.4.4 Sevage法 取粗多糖溶液（0.5mg/mL）50mL，加入12.5mL的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），搅拌1.5h，8000r/min离心10min，收集上清液，测定蛋白和多糖含量，计算蛋白去除率和多糖损失率。

1.2.5 体外抗凝血实验 参照文献[16]的方法，取健康人新鲜血液与100mmol/L枸橼酸钠，按体积比9∶1混匀，3000r/min离心10min，收集离心上层液体，获得贫血小板血浆。取地参精制总多糖，用生理盐水分别配制成10、50、100、150、200mg/L的溶液，分别与待测血浆按1∶4的体积比混合。并以地参多糖溶液相应等体积的肝素钠及生理盐水处理待测血浆，分别作为阳性和阴性对照。用Sysmex-CA7000全自动凝血仪测定APTT、PT和TT值。

1.3 统计分析 每试验设3次重复，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，采用origin86软件作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线 按照实验方法进行操作在波长490nm处测定吸光度。以浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图1所示。由图1可知，回归方程为y=0.161x-0.014，R2=0.9998，表明该方程精密度很好，可用于后续多糖的测定。

2.2 蛋白质浓度标准曲线 以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，按实验方法，以BSA的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图2所示。由图2可知，回归方程为y=0.0253x+0.0139，R2=0.9963，表明该方程精密度很好，可用于后续多糖中蛋白质浓度的测定。

2.3 多糖溶液最大吸收波长 对地参多糖的水溶液于200～700nm波长范围内进行全波长扫描，发现溶液在490nm下有较大吸光度，如图3所示。在以后续试验中采用此波长对色素的去除率进行测定。

2.4 地参多糖脱色效果 脱色后的多糖溶液于波长为490nm下对脱色去除率进行测定，以多糖损失率为指标，考察不同浓度的活性炭、H2O2对多糖脱色的效果。从表1对比可知，活性炭对地参多糖水溶液中色素具有良好的去除作用，其脱色效果较过氧化氢好，多糖损失率较低。脱色剂以及用量不同对多糖脱色效果显示出差异，而用量升高时多糖损失率明显增加。所以选择终深度为1.0%的活性碳对地参多糖进行脱色。

2.5 地参多糖脱蛋白效果 由表2可知，脱蛋白效果最好的为三氯乙酸-正丁醇法，该法去除蛋白质的同时多糖损失率也较低。

2.6 体外抗凝血实验结果 由表3可知，与生理盐水组相比，在10～200mg/L剂量范围内，地参多糖对APTT和PT影响显著，而对TT无影响。在50～200mg/L剂量浓度范围，地参多糖对APTT的影响明显高于肝素钠。结果提示地参多糖有较好的抗凝血活性。

3 结论与讨论

水提醇沉提取方法得到的地参粗多糖有较多的蛋白质和较深的颜色，蛋白质和色素的存在影响多糖的纯度，从而影响其生物活性，阻碍了对多糖的组成和结构的研究。因此，脱色和脱蛋白在多糖纯化过程中有着非常重要的意义[17]。过氧化氢对地参多糖的脱色效果较活性炭差，且多糖损失率较高。实验中较高浓度的活性炭的脱色效果较好，但由于活性炭对色素吸附的同时也会吸附掉部分多糖，造成多糖损失，故在脱色剂用量的选择上，应同时考虑脱色效果与多糖损失两者的综合效应。本研究选用终浓度为1%的活性碳对地参多糖水溶液进行脱色1次脱色率就能达到（91.56±0.87）%，多糖损失率仅为（8.39±0.74）%，结果表明，终浓度为1%的活性碳吸附除去地参多糖提取液中的色素是较好的方法。

多糖主要以2种形式存在，一是纯糖链，另一种是糖链与肽链结合，形成的糖肽或糖蛋白。多糖脱蛋白主要是去除游离蛋白质，因此在选择脱蛋白方法时应该注意避免多糖-蛋白质复合物的降解，从而造成多糖-蛋白质复合物特有的生理活性下降。比较4种多糖脱蛋白方法，脱蛋白效果最好的为三氯乙酸-正丁醇法，经该方法处理的地参多糖提取液，蛋白质去除率为（80.28±0.98）%，多糖损失率为（9.67±0.97）%。体外抗凝血实验结果表明，地参多糖抗凝血活性有濃度依赖性，地参多糖对APTT和PT影响显著，而对TT无影响。在50～200mg/L剂量浓度范围，地参多糖对APTT的影响明显高于肝素钠，表明地参多糖有较好的抗凝血活性。本研究可为地参多糖的分离纯化及其生物学活性的研究提供基础。

参考文献

[1]季字彬.中药多糖的化学与药理[M].北京：人民卫生出版社，2005.

[2]许慧，黄丽英.植物多糖生物活性的研究进展[J].福建医科大学学报，2010，44（1）：79-82.

[3]宁安红，曹静，魏彬，等.灵芝多糖对小鼠肿瘤的抑制机制作用及免疫指标的观察[J].肿瘤研究与临床，2004，16：147-151.

[4]李丽，王乃平.植物多糖的药理作用研究纂要[J].中医药学刊，2004，10：158-160.

[5]赵俊，吴宏，王亚平.人参多糖的化学与药理学研究进展[J].国外医学：中医中药分册，2004，26（2）：79-81.

[6]王有国.血黏导致脑梗阻[J].中国心血管病研究杂志，2001（2）：19-20.

[7]Thomas DP. Does low molecular weight heparin casuse less bleeding[J].Thrombosis and Haemostasis，1997，78：1422-1425.

[8]周永国，杨越冬，王树元，等.天然活性多糖在生物医药领域中的研究进展[J].高分子通报，2006（9）：16-22.

[9]马乐萍，田丽萍，马文玉，等.籽瓜多糖脱色和脱蛋白工艺研究[J].食品科技，2018，43（06）：204-209.

[10]贾文聪，伊明·尕哈甫，古丽格娜·吐尔地，等. 黑果枸杞多糖提取及脱蛋白、脱色最佳工艺的研究[J].新疆医科大学学报，2018，41（07）：900-906.

[11]张陆军，丁怡，陈芸芸，等.太子参多糖制备工艺研究[J].中国中药杂志，2004，29（12）：1201-1203.

[12]马秀俐，郝春燕，朱伟，等.西洋参多糖5-2的分离、性质和活性研究[J].中国药学杂志，1998，33（8）：494-496.

[13]陈贵元，张翠香，罗永会，等.地参多糖的提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（21）：38-40.

[14]宁丽，郭立忠，王志华，等.白灵菇子实体的氨基酸及多糖含量的测定[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2007，24（2）：94-96.

[15]曲春季，沈颂东，王雪峰，等.用考马斯亮蓝测定植物粗提液中可溶性蛋白质含量方法的研究[J].苏州大学学报（自然科学版），2006，22（2）：82-84.

[16]吴小燕.黑木耳多糖提取分离纯化及体外抗凝血活性[D].芜湖：安徽工程大学，2016.

[17]于晓红，吴宪玲，付薇，等.西洋参多糖脱色脱蛋白方法研究[J].中国食品学报，2017，17（11）：145-149. （责编：张宏民）