神经肽FF对类风湿关节炎小鼠模型的治疗作用研究

孙韬　王春霞　李东海 马艳云

【摘 要】目的：探讨神经肽FF（NPFF）对类风湿关节炎DBA/1小鼠模型的治疗作用。方法：将30只DBA/1小鼠随机分为胶原诱导性关节炎（CIA）模型组、NPFF治疗组、健康对照组，每组10只。CIA模型组和NPFF治疗组利用牛Ⅱ型胶原诱导法建立小鼠类风湿关节炎模型，造模后，NPFF治疗组小鼠腹腔注射NPFF 30 mg·kg-1，每周3次，连续2周。CIA模型组腹腔注射同体积的生理盐水作为对照。治疗结束后对小鼠关节炎指数进行评分，检测各组小鼠血清中细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-17的含量水平，取小鼠后足踝关节进行病理学观察及评分。结果：与CIA模型组比较，NPFF治疗的CIA小鼠能够明显减轻CIA小鼠的临床症状；明显抑制CIA小鼠多发性关节炎的发生（P = 0.004）；显著降低小鼠血清TNF-α（P = 0.000）、IL-1β（P = 0.001）和IL-17（P = 0.001）的含量水平；减少滑膜细胞增殖（P = 0.010）、炎性细胞浸润（P = 0.007）、血管翳产生（P = 0.005）、炎症（P = 0.002）和骨质侵蚀（P = 0.003）的发生。结论：NPFF对DBA/1小鼠类风湿关节炎具有治疗作用，血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17的显著降低是NPFF治疗类风湿关节炎可能的作用机制。

【关键词】 关节炎，类风湿；神经肽FF；细胞因子；抗炎；小鼠

On the Therapeutic Effect of NPFF on Mouse Models with Rheumatoid Arthritis

SUN Tao，WANG Chun-xia，LI Dong-hai，MA Yan-yun

【ABSTRACT】Objective：To investigate the therapeutic effect of neuropeptide FF（NPFF）on DBA/1 mice models with rheumatoid arthritis.Methods：Thirty DBA/1 mice were randomly divided into a collagen-induced arthritis（CIA）model group，an NPFF treatment group and a healthy control group，with 10 mice in each.In the CIA model group and NPFF treatment group，the models of rheumatoid arthritis were induced by bovine type II collagen.After modeling，the mice in the NPFF treatment group were given an intraperitoneal injection of

30 mg·kg-1 NPFF，3 times per week for 2 weeks.While those in the CIA model group were given an intraperitoneal injection of the same volume of normal saline.After treatment，scores were made on mice arthritis index，and the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-1β and IL-17 in serum were detected.Ankle joints of mouses pleopoda were isolated for pathological observation and scoring.Results：Compared with the CIA model group，clinical symptoms of CIA mice treated with NPFF were significantly improved；the occurrence of polyarthritis in CIA mice was obviously inhibited（P = 0.004）；the contents of TNF-α（P = 0.000），IL-1β

（P = 0.001）and IL-17（P = 0.001）were significantly reduced；and synoviocyte proliferation（P = 0.010），

inflammatory cell infiltration（P = 0.007），pannus generation（P = 0.005），inflammation（P = 0.002）and bone erosion（P = 0.003）were decreased.Conclusion：NPFF has a therapeutic effect on rheumatoid arthritis in DBA/1 mice，and the significant reduction of inflammatory cytokines TNF-α，IL-1β and IL-17 in serum may be the mechanism of treating rheumatoid arthritis with NPFF.

【Keywords】arthritis，rheumatoid；NPFF；cytokine；anti-inflammation；mice

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的以滑膜炎及软骨损伤为特点的慢性自身免疫性疾病[1]。大量研究表明，促炎因子参与RA的发病过程，尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-17可引起软骨损伤及骨质侵蚀。TNF-α在关节炎症过程中表现出高度释放，特别是在炎症疾病活动加重期[2]。IL-1β作为炎症的始动因子，不仅会对机体细胞产生损伤，还会诱导其他细胞产生另外的炎性因子，造成更为严重的炎症反应[3]。IL-17已经被证实在RA过程中可诱导产生TNF-α和IL-1β，并且造成骨关节的破坏[4-5]。牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎（CIA）动物模型广泛用于RA疾病研究，其优点在于可精确模拟RA患者的临床症状及病理学改变，特别是在关节炎、骨侵蚀及血管翳产生等方面[6]。有证据表明，CIA动物模型血清中IL-1β和IL-17均呈高浓度

表达[7]。

神经肽FF（NPFF）作为一种内源性神经肽在1985年被首次报道。研究人员证实了NPFF具有多种生理学功能，包括镇痛、阿片调节、心血管调节、免疫调节、抗炎等[8]。但是，国内外关于NPFF对RA的抗炎活性研究尚未见报道。本实验通过建立CIA模型，对小鼠进行关节炎评分、血清细胞因子检测及组织病理学分析，深入研究NPFF抑制RA炎症过程及部分相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性DBA/1小鼠30只，7～8周龄。购于北京华阜康生物科技有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2014-0004。小鼠置于环境温度20～24 ℃，相对湿度为45%～55%的动物实验室适应性饲养1周后开始实验。小鼠可自由摄食饮水，自然光线照明，室内通风良好，动物使用许可证号SYXK（军）2012-0029。

1.2 药物及试剂 牛Ⅱ型胶原（批号140158）、弗式完全佐剂（批号140373）和弗氏不完全佐剂（批号140490）均购于美国Chondrex公司；小鼠TNF-α（批号12198009）、IL-1β（批号119172026）和IL-17（批号120657018） ELISA检测试剂盒均购于奥地利eBioscience公司；NPFF（批号15013091）购于中国波泰生物科技有限公司。

1.3 CIA小鼠模型的建立及给药 将30只DBA/1小鼠随机分为CIA模型组、NPFF治疗组、健康对照组，每组10只。健康对照组不做任何处理，对其他2组小鼠进行造模：将2 mg·mL-1牛Ⅱ型胶原与1 mg·mL-1弗氏完全佐剂等体积混合，乳化，制成终浓度为1 mg·mL-1的乳剂。将制备后的乳剂于每只小鼠的尾根部处皮下注射0.1 mL进行初次免疫，并记为造模第0天；在造模第21天，

将2 mg·mL-1牛Ⅱ型胶原与1 mg·mL-1弗氏不完全佐剂等体积混合，乳化，制成终浓度为1 mg·mL-1的乳剂，再次于每只小鼠尾根部皮下注射0.1 mL进行二次免疫。造模第22天开始对NPFF治疗组小鼠进行腹腔注射给药NPFF，

30 mg·kg-1，每周3次，连续2周。CIA模型组腹腔注射同体积的生理盐水作为对照。初次免疫后第49天将各组小鼠处死取样。

1.4 检测指标

1.4.1 足肿胀变化情况 二次免疫后，每隔4天，分别测量各组小鼠左、右后足趾厚度。肿胀厚度（mm） = 左足趾厚度（mm） - 右足趾厚度（mm）。每只小鼠左、右后足趾厚度均值作为统计数据。

1.4.2 关节炎评分 二次免疫后，每隔4天，进行一次关节炎指数评分。关节炎评分标准：0分，无红肿；1分，小趾关节肿胀；2分，趾关节和足趾肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀[9]。

1.4.3 血清TNF-α、IL-1β和IL-17水平检测 摘眼球取血1 mL左右，室温放置30 min后，置于3000 r·min-1离心机离心10 min，利用小鼠ELISA试剂盒分别检测各组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17含量水平。

1.4.4 踝关节组织病理学观察及评分 首次免疫后第49天，取各组小鼠后足炎性踝关节组织10%甲醛固定进行HE染色，观察组织病理改变，并进行病理评分。各组小鼠的踝关节病理分别从滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀这五项指标进行评分统计[10]。①滑膜细胞增殖评分标准：0分，无增殖；1分，轻微增殖，2～4层

滑膜细胞；2分，中度增殖，4层以上滑膜细胞；

3分，滑膜细胞过度增殖。②炎性细胞侵蚀评分标准：0分，无侵蚀；1分，较少的局部侵蚀；2分，广泛的局部侵蚀；3分，广泛侵蚀到关节囊，伴有凝聚体的形成。③血管翳评分标准：0分，无改变；1分，2个部位出现血管翳；2分，4个部位出现血管翳，伴有软骨表面的侵蚀；3分，4个以上部位出现血管翳或者2个部位出现大范围的血管翳。

④炎症评分标准：0分，无炎症；1分，轻度炎症，出现1个聚集物或较少的分散白细胞浸润；2分，中度炎症，2个及以上的白细胞聚集物；3分，重度炎症，白细胞融合，分散浸润明显。⑤骨质侵蚀评分标准：0分，正常；1分，小量侵蚀，1～2个

小的浅表部位；2分，少量侵蚀，1～4个中等大小和深度部位；3分，中等侵蚀，5个以上部位，局部侵蚀到骨皮质；4分，重度侵蚀，多重损伤，局部或完全侵蚀到骨皮质；5分，广泛损伤，皮质穿透骨长度的25%以上。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多样本均数比较用t检验，两两比较采用双因素方差分析（Tukey's post-tests）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠足肿胀变化情况 初次免疫第21天，小鼠逐渐开始发病，指关节红肿症状多见于后足趾间关节、踝关节并累及前足趾。造模第41天，与CIA模型组小鼠比较，NPFF治疗组小鼠足肿胀被显著抑制（P = 0.005），抑制作用持续至第49天

（P = 0.003）；健康对照组无任何明显肿胀变化。见图1。

造模第49天，CIA模型组小鼠足掌及踝关节部位肿胀明显；NPFF治疗组小鼠的临床症状明显减轻，踝关节未出现明显肿胀；健康对照组则无任何明显肿胀变化。见图2。

2.2 关节炎评分 小鼠在二次免疫后开始给予药物治疗，NPFF（30 mg·kg-1）腹腔注射给药，每周3次，治疗2周后，对各实验组小鼠进行关节炎评分。结果表明，NPFF治疗在首次免疫41 d 时表现出明显地抑制CIA小鼠多发性关节炎的发生

（P = 0.004），并且抑制作用持续至第49天（P = 0.003）。

见图3。

2.3 血清内细胞因子检测 首次免疫后第49天，摘眼球取血1 mL左右，离心取血清分别检测TNF-α、IL-1β和IL-17含量水平。结果显示，健康对照组、CIA模型组和NPFF治疗组小鼠血清TNF-α含量分别为（158.9±17.53）pg·mL-1、（570.1±

84.81）pg·mL-1、（336.6±37.32）pg·mL-1，方差

分析3组TNF-α含量水平差异有统计学意义

（F = 14.350，P = 0.000）。两两比较结果显示，CIA模型组的血清TNF-α含量水平较健康对照组明显升高（P = 0.000）；NPFF治疗组与健康对照组之间差异无统计学意义（P = 0.072）；NPFF治疗组的血清TNF-α含量水平较CIA模型组明显减低

（P = 0.014）。见图4（1）。

健康对照组、CIA模型组和NPFF治疗组小鼠血清IL-1β含量分别为（26.55±4.91）pg·mL-1、（62.25±7.54）pg·mL-1、（38.03±6.02）pg·mL-1。方差分析3组TNF-α含量水平，差异有统计学意义（F = 8.501，P = 0.001）。两两比较结果显示，CIA模型组的血清IL-1β含量水平较健康对照组明显升高（P = 0.001）；NPFF治疗组与健康对照组之间差异无统计学意义（P = 0.408）；NPFF治疗组的血清IL-1β含量水平较CIA模型组明显减低（P = 0.028）。见图4（2）。

健康对照组、CIA模型组和NPFF治疗组小鼠血清IL-17含量分别为（30.07±4.10）pg·mL-1、（75.68±6.24）pg·mL-1、（48.80±6.02）pg·mL-1。方差分析3组IL-17含量水平，差异有统计学意义（F = 18.960，P = 0.000）。两两比较结果显示，CIA模型组的血清TNF-α含量水平较健康对照组明显升高（P = 0.000）；NPFF治疗组与健康对照组之间差异无统计学意义（P = 0.066）；NPFF治疗组的血清IL-17含量水平较CIA模型组明显减低（P = 0.033）。见图4（3）。

2.4 小鼠足趾组织病理学评分 首次免疫后第49天

处死小鼠，分别取健康对照组、CIA模型组和NPFF治疗组小鼠后足炎性踝关节组织进行HE染色切片，观察组织病理改变。结果显示，健康对照组小鼠无滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、血管翳产生以及骨侵蚀表现；CIA模型组有明显的滑膜组织增生、炎性细胞浸润、血管翳产生以及部分骨质侵蚀；NPFF治疗组则表现出少量滑膜细胞增殖，衬覆1～2层滑膜细胞，少量中性粒细胞浸润以及轻微的骨侵蚀表现。见图5。

分别对3组小鼠的后足踝关节组织从滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、血管翳产生、炎症和骨质侵蚀方面进行评分，结果显示，健康对照组小鼠各项指标病理评分为0分，NPFF治疗组较CIA模型组小鼠在各项指标病理评分上明显降低。

见表1。

3 讨 论

RA是一种以关节的慢性、反复发作性炎症为特点的自身免疫性疾病。尽管NPFF对RA的抗炎活性研究还未见报道，但多项研究证实NPFF参与炎症过程。1992年，Lecron等[11]发现T细胞表明存在NPFF结合位点，随后Lecron等[12]发现NPFF可调节T细胞活性。在角叉菜胶诱导的大鼠炎症模型[13]和肠炎大鼠模型[14]上，脊髓部位NPFF2受体的表达有明显上调。最近，Sun等[15]发现NPFF2受体在炎症巨噬细胞上具有功能性表达；NPFF能够抑制脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞产生胞内炎症因子一氧化氮（NO）的浓度；同时腹腔注射NPFF能够明显降低小鼠的足肿胀炎症反应。以上研究证据充分表明NPFF系统参与体内抗炎过程。因此笔者通过建立CIA小鼠模型，探究了NPFF对RA的治疗作用及其相关作用机制。结果显示，给予NPFF治疗明显地减轻了CIA小鼠的临床症状，在足肿胀厚度改变、关节炎评分以及病理学评分等方面，NPFF治疗组均低于CIA模型组，说明NPFF可以抑制牛Ⅱ型胶原诱导产生的小鼠关节炎反应。尽管RA的发病机制尚不十分清楚，但促炎症细胞因子在RA疾病发生发展过程中高水平的表达已经得到公认，特别是血清TNF-α、IL-1β和IL-17含量水平显著升高与RA密切相关。TNF-α主要由巨噬细胞分泌产生，在炎症活动期可高水平表达。IL-1β作为炎症的始动因素，可抑制软骨细胞蛋白多糖的合成，并且促进炎性细胞的聚集，加重关节局部炎症反应。IL-17是关节炎症过程中的上游炎症细胞因子，可刺激产生TNF-α和IL-1β，进一步造成软骨破坏和关节损伤[16]。基于以上的研究证据，笔者又检测了各实验组小鼠的血清TNF-α、IL-1β和IL-17。结果显示，NPFF治疗组小鼠血清的各项细胞因子含量水平均低于CIA模型组小鼠的细胞因子含量水平，说明NPFF能够降低炎症状态时血清炎性细胞因子的释放，同时这些炎性细胞因子浓度降低也可能是导致CIA小鼠临床症状减轻的一种可能的作用机制。

目前，多肽药物已被广泛用于肿瘤、糖尿病、HIV及心血管等疾病的治疗[17]。关于NPFF，自从被发现以来，研究人员一直致力于对其多样的生理活性进行研究，并且已经取得了一定成果[18]。据调查，目前对于NPFF研究的多数报道只停留在对其生物活性层面，尚未见到NPFF作为药物治疗的临床研究，这也预示着该肽在治疗疾病方面可能具有较大的发展空间。通过建立CIA小鼠模型，首次探究了NPFF在治疗RA方面的抗炎活性，并且初步阐明了其可能的作用机制，（下转第14页）

（上接第9页）这将为NPFF在炎症领域的研究提供一种新的线索，也为该肽成为RA可能的治疗药物提供了重要的研究依据。

4 参考文献

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收稿日期：2016-04-11；修回日期：2016-05-12