斑蝥素、斑蝥酸钠和斑蝥酸镁抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的研究

梁金龙，谢　铭，杨雪峰，李建国，郑兴斌

(遵义医学院附属医院，贵州 遵义　563000)



斑蝥素、斑蝥酸钠和斑蝥酸镁抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的研究

梁金龙，谢铭，杨雪峰，李建国，郑兴斌

(遵义医学院附属医院，贵州 遵义563000)

摘要:目的比较斑蝥素、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，筛选出最佳斑蝥素类抗肿瘤药物。方法将斑蝥素、 斑蝥素酸钠及斑蝥素酸镁作用于人胃癌细胞SGC-7901；采用CCK-8法检测上述三种药物对SGC-7901细胞的生长抑制率。结果斑蝥素、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁均对SGC-7901细胞有抑制作用，且呈效应-剂量关系。上述三种药物的半数抑制浓度分别为18.591、17.676、4.105 μmol·L(-1)。结论斑蝥素、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁均能抑制人胃癌细胞生长，其中斑蝥素酸镁的抗肿瘤活性最佳。

关键词:斑蝥素；斑蝥素酸钠；斑蝥素酸镁；SGC-7901细胞；增殖抑制率

斑蝥素是从斑蝥中提取出来并具有较强抗肿瘤活性的中药，但因毒副作用明显[1]，从而限制了其在临床上的广泛应用。随着人们对斑蝥素研究的不断深入，多种斑蝥素类衍生物也相继合成，如斑蝥素酸钠、斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钙及去甲斑蝥素等。近年来，许多文献都报道了关于斑蝥素和斑蝥素衍生物作用于肿瘤细胞的研究，结果显示它们的抗癌效果确切[2-4]，而关于斑蝥素酸镁作用胃癌的研究却少有报道。因此，我们设计了该实验，期望通过对斑蝥素、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁的体外抗肿瘤活性的比较，筛选出抗肿瘤活性最佳的斑蝥素类衍生药物。现报道如下。

1材料与仪器

1.1材料人胃癌细胞SGC-7901由遵义医学院消化内科惠赠。斑蝥素、斑蝥素酸钠及斑蝥素酸镁由遵义医学院寄生虫教研室合成。胎牛血清、CCK-8试剂均购自TRANSGen BIOTECH公司。

1.2仪器美国 Thermo 公司产Multiskanspectrum 酶标仪；上海睿钰生物有限公司产Count start自动细胞计数仪。

2方法

2.1细胞培养及种板将细胞培养于含12%新生胎牛血清的RPMI-1640培养液中。取对数生长期细胞,加入0.25%胰蛋白酶消化,加入含血清培养液， 吹打制成单细胞悬液。自动细胞计数仪计数悬浮细胞密度，加入适量含血清培养液，配成密度为8×107·L-1细胞悬液，接种于96 孔平板,每孔100 μL。放入孵箱过夜。

2.2分组斑蝥素组设为：溶剂对照组、实验对照组、5.1、10.20、20.40、40.80 μmol·L-1；斑蝥素酸钠组：实验对照组、4.375、8.75、17.5、35.00 μmol·L-1；斑蝥素酸镁组：实验对照组、1.04、2.08、4.17、8.34 μmol·L-1；另设空白对照组。

2.3加药用含血清培养液将斑蝥素(10%丙酮溶解)、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁分别稀释为上述浓度，依次从低到高浓度全量置换，每个浓度复种3孔。其中，溶剂对照组加入含0.4%丙酮溶液(用含血清培养液稀释)。空白组为含血清培养液(无细胞)。加药完毕，继续置于孵箱培养24 h。

2.4CCK-8检测法取出平板，按说明书操作，加入CCK-8试剂，放入培养箱中继续孵育1～2 h后， 酶标仪检测吸光光度值(OD值)，波长450 nm。

用回归曲线求50%细胞抑制率时的药物浓度(IC50) 。抑制率的计算公式为:

抑制率(%) =[1-(药物组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%

3结果

3.1斑蝥素对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用斑蝥素对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用见表1。斑蝥素浓度在5.10～40.80 μmol·L-1时， 与细胞增殖抑制率成正相关。表1中示：溶剂对照组与实验对照组相比较，P>0.05,差异无统计学意义，即溶解在实验浓度斑蝥素中的丙酮对细胞增殖无影响；当斑蝥素浓度为40.80 μmol·L-1时，最大抑制率为67.78%；当斑蝥素浓度为10.20和20.40 μmol·L-1时，抑制率分别为34.12%和55.41%，抑制中浓度应在10.20～20.40 μmol·L-1之间。以药物浓度为横坐标、 抑制率为纵坐标作对数曲线， 得回归方程Y=1.338Ln(X)+18.294，r=0.907。经计算， 得半数抑制浓度(IC50)为18.591 μmol·L-1。

处理组斑蝥素浓度/μmol·L-1OD抑制率/%空白对照组00.1075±0.009—溶剂对照组01.0358±0.104—实验对照组01.0789±0.268—T1组5.100.9541±0.17814.01T2组10.200.7544±0.16134.12T3组20.400.5739±0.09355.41T4组40.800.4473±0.08467.78

注：空白对照组：仅含培养液；实验对照：有细胞但无斑蝥素处理；溶剂对照组:含0.4%丙酮溶液；T1～T4：不同浓度斑蝥素处理组。

3.2斑蝥素对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响斑蝥素对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响见图1。图1中a为斑蝥素组中溶剂对照，b为斑蝥素组实验对照， a与b相比，细胞形态未见明显变化，以活细胞为主；而从c中可以看出，斑蝥素作用后的细胞密度减小，形态明显改变，皱缩、变圆变亮，细胞几乎全死亡。

3.3斑蝥素酸钠对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用斑蝥素酸钠对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用见表2。斑蝥素酸钠浓度在4.375～35.00 μmol·L-1时， 对肿瘤细胞的增殖表现出明显抑制作用， 且随着浓度增加而增强。当浓度为17.5和35 μmol·L-1时，OD450值差异不显著，最大抑制率为62.57%；当浓度为8.75和17.5 μmol·L-1时，癌细胞生长明显被抑制，抑制率分别为38.37%和53.03%，抑制中浓度应在8.75～17.5 μmol·L-1之间。以药物浓度为横坐标、抑制率为纵坐标作对数曲线，得回归方程Y=1.297Ln(X)+21.308，r=0.892。经计算， 得半数抑制浓度(IC50)为17.676 μmol·L-1。

图1　斑蝥素对人胃癌细胞SGC-7901

注：a：溶剂对照组;b：实验对照组;c：斑蝥素处理组。

±s)

注：空白对照组：仅含培养液；实验对照：有细胞但无斑蝥素钠处理；T1～T4：不同浓度度斑蝥素酸钠处理组。

3.4斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响斑蝥酸钠对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响见图2。图2中a为斑蝥酸钠组实验对照，b为斑蝥酸钠药物组； a与b进行对比，可见斑蝥酸钠作用后的细胞密度明显小于对照组；细胞形态明显改变，皱缩、变圆变亮，细胞几乎全死亡。

图2　斑蝥素钠对人胃癌SGC-7901细胞形态的

注：a：实验对照组;b：斑蝥素钠处理组。

3.5斑蝥素酸镁对人胃癌细胞SGC-7901增殖

抑制作用斑蝥素酸镁对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用见表3。斑蝥素酸镁浓度在1.04～8.34 μmol·L-1时， 对人胃癌细胞SGC-7901的增殖表现出显著抑制。当浓度为1.04 μmol·L-1时，细胞增殖抑制率已达30.03%；当浓度为1.04和2.08 μmo·L-1时，OD450值差异不明显；当浓度为4.17 μmol·L-1和8.35 μmol·L-1时OD450值差异不显著，最大抑制率为60.09%；当浓度为2.08 和4.17 μmol·L-1时，抑制率分别为38.37%和52.01%，因此可知，斑蝥素酸镁的抑制中浓度应在2.08～4.17 μmol·L-1之间。以药物浓度为横坐标、 抑制率为纵坐标作对数曲线， 得回归方程Y=3.957Ln(X)+29.664，r=0.948。经计算， 得半数抑制浓度(IC50)为4.105 μmol·L-1。

±s)

注：空白对照组：仅含培养液；实验对照：有细胞但无斑蝥素镁处理；T1～T4：不同浓度斑蝥素酸镁处理组。

3.6斑蝥酸镁对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响斑蝥酸镁对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响见图3。图3中a为斑蝥酸镁组实验对照，b为斑蝥酸镁药物组。a与b进行对比，可见斑蝥酸镁作用后的细胞变得稀疏、分离；形态明显改变，皱缩、变圆变亮，细胞几乎全死亡。

4讨论

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高，严重威胁着人类健康[5]。近年来，关于斑蝥素及其衍生物作用于胃癌细胞的研究大量开展，在李晓飞等[6]的研究中显示：斑蝥素类衍生物与斑蝥素相比较，前者具有更好的抗肿瘤活性，且毒性大大降低。此外，斑蝥素盐类药物易溶于水[7-8]，使机体更容易吸收。目前，市场上销售的斑蝥素类药物种类繁多，如斑蝥素酸钙、斑蝥酸酸钾和去甲斑蝥素等。斑蝥素及斑蝥素衍生物可能是通过以下几种机制发挥抗肿瘤效应：(1)诱导细胞凋亡：通过上调或下调某些与细胞凋亡密切相关的基因如Bax、Bcl-2的表达，从而实现对细胞增殖的调控[3]。(2)影响细胞增殖周期：干预细胞有丝分裂的过程，将细胞阻滞于分裂的不同时期，从而影响细胞的增殖。Li等[9]发现斑蝥素能下调胰腺癌细胞内CDK1的表达，增强CDK抑制因子P21的表达， 从而使胰腺癌细胞阻滞于G2/M期；在郑乔丹等[10]的研究中也表明，斑蝥素可通过上调p21 表达而抑制 CDK1的活性，从而导致细胞G2/M期阻滞。斑蝥素酸镁能将人胃癌SGC-7901细胞明显阻滞于S期。(3)抑制肿瘤细胞侵袭和转移：斑蝥素通过下调细胞NF-κB(P65)、NF-κB(P65) mRNA、Caspase-3、Smad3的表达和FAK 酪氨酸磷酸化水平，抑制蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[11]。(4)抑制肿瘤血管生成Zhang等[12]研究发现去甲斑蝥素通过抑制VEGFR2/MEK/ERK信号通路激活， 削弱了VEGF的作用， 减少了肿瘤血管生成。(5)抑制淋巴管的生成，从而影响肿瘤细胞浸润、转移。正是斑蝥素类衍生药物具有较强的抗肿瘤细胞增殖的作用，抗癌效果明显，且与斑蝥素相比，具有高效、低毒的优势，使其在临床上得以广泛应用。

图3　斑蝥素镁对人胃癌SGC-7901细胞形态学的影响(20×10)

注:a：实验对照组；b：斑蝥素镁处理组。

本文比较了斑蝥素、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响,研究结果显示:斑蝥素、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸镁均能抑制癌细胞生长，其中斑蝥素IC50为18.591 μmol·L-1；斑蝥素酸钠IC50为17.676 μmol·L-1；斑蝥素酸镁IC50为4.105 μmol·L-1。三种药物均能有效的抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖，且抑制作用呈效应—剂量关系，与其他文献报道相符[13]。其中， 斑蝥素酸镁抑制中浓度(IC50)最小，斑蝥素酸钠次之。结果表明了人胃癌细胞SGC-7901对斑蝥素酸镁较敏感，斑蝥素酸钠次之，斑蝥素最差。提示斑蝥素酸镁治疗胃癌的效果可能优于斑蝥素和斑蝥素酸钠。此外，实验结果中还显示：当浓度为17.5 和35 μmol·L-1时，OD450值差异不显著；当浓度为4.17和8.35 μmol·L-1时OD450值差异不显著。而在张恒等[14]的研究中也存在类似现象。或许可以推测斑蝥素衍生物作用肿瘤细胞时，其抑制率达到一定程度后不再随着浓度的增加而显著改变。这就需要我们开展更多的实验，增加浓度梯度来证实这一猜想，为探索斑蝥素类药物的安全有效浓度提供实验依据。

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Research on Cantharidin,Sodium cantharidinate and magnesium cantharidate Inhibition of proliferation of human gastric cancer cell SGC-7901

LIANG Jin-long，XIE Ming，YANG Xue-feng，et al

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000，China)

Abstract:ObjectiveTo compare the inhibitory effects of cantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium on human gastric cancer cell ( SGC-7901) proliferation,and to screen out the most efficacious cantharidin antineoplastic drug.MethodsTo detect the inhibitory rate of the proliferation of SGC-7901 cells of cantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium by CCK-8 assay after the three drugs were applied to these cells.ResultsCantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium have inhibitory effect on SGC-7901 cells,and showed a dose-response relationship. The median inhibitory concentrations of these three drugs were 18.591,17.676,4.105 μmol·L(-1) respectively.ConclusionCantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium can inhibit human gastric cancer SGC-7901 cell growth,and the antitumor activity of cantharidin magnesium ranks the best.

Key words：cantharidin;cantharidin sodium;cantharidin magnesium;SGC-7901 cells;proliferation inhibitory rate

(收稿日期：2015-10-12，修回日期：2015-12-06)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.09

作者简介：梁金龙，男，硕士研究生通信作者： 谢铭，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：消化道肿瘤，E-mail： 617720897@qq.com

基金项目：贵州省中医药管理局项目(No QZYY-2014-005)