Box-Behnken效应面法优化α-细辛脑长循环纳米粒制备工艺

臧巧真， 唐 涛， 龙凯花， 王春柳， 辛永洁， 李 晔*

（1.陕西中医学院，陕西咸阳712046；2.陕西省中医药研究院，陕西西安710003）



Box-Behnken效应面法优化α-细辛脑长循环纳米粒制备工艺

臧巧真1， 唐 涛1， 龙凯花1， 王春柳2， 辛永洁2， 李 晔2*

（1.陕西中医学院，陕西咸阳712046；2.陕西省中医药研究院，陕西西安710003）

摘要:目的 采用Box-Behnken效应面法，优化聚山梨酯80修饰的α-细辛脑长循环纳米粒的制备工艺条件。方法 以MPEG-PLGA的浓度、MPEG-PLGA与药物的比例和F68的浓度为考察因素，包封率和载药量为评价指标，根据Box-Behnken设计原理进行实验安排，并用多元线性回归及二项式拟合建立指标与因素之间的数学关系，效应面法预测最佳工艺条件。结果 各指标的二项式拟合方程均优于多元线性回归方程，以优化工艺条件下制备的纳米粒的平均粒径为（95.82±3.41）nm，包封率为（87.50±1.72）％，载药量为（14.44±0.81）％。结论 该方法适用于α-细辛脑纳米粒的工艺优化，所建立数学模型的预测性良好。

关键词:α-细辛脑；长循环纳米粒；聚山梨酯80；多元线性回归；二项式拟合；Box-Behnken效应面法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.052

α-细辛脑［1］（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲的主要活性成分之一，又名α-细辛醚、细辛醚和细辛脑（asarone）。大量研究资料表明，α-细辛脑可通过提高脑组织的兴奋阈，抑制来自病灶的兴奋扩散，从而对癫痫有良好的治疗效果，并且毒副作用小［2］。由于它是脂溶性极强的化合物，故口服普通制剂的生物利用度低，如其胶囊剂和片剂仅分别为2.73％和5.56％［3］。因此，提高α-细辛脑的生物利用度及脑靶向性，具有重大意义。

普通的纳米粒易被高吞噬性单核吞噬细胞系统（Mononuc1ear Phagocyte System，MPS）识别和吞噬，从而富集于肝、脾等器官，使得药物在血液中的循环时间缩短［4］。研究表明，纳米粒的表面用PEG、PEO、MPEGPLGA等亲水性高分子材料修饰后，能形成水化保护层，并具备立体位阻效应，从而不被MPS识别，达到长循环的目的［5］，而被聚山梨酯80修饰过的纳米粒的脑靶向性明显增强，研究表明，其可吸附血液中的APo B或E，从而通过LDL受体介导纳米递药系统，经胞吞转运入脑［6-7］。

Box-Behnken效应面法［8］具有方法简便、实验次数少、可采用三维效应面进行数据处理、拟合和模型预测性好等优点，是近年来国外药学工作者常用的方法，适用于多因素多水平试验设计。本实验制备聚山梨酯80修饰的α-细辛脑长循环纳米粒，并采用Box-Behnken效应面法对其制备工艺进行优化。

1 实验材料

1.1 仪器 Agi1ent 1260色谱柱，包括G1311B四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G4212B二极管阵列检测器、LAB oPen色谱数据工作站（美国Agi1ent公司）；Sartorius BP211D电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；超纯水系统，包括UFC501096超滤管（美国Mi11iPore公司）；KQ-250DE超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；HJ-6多头磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司）；R-3旋转蒸发仪（瑞士布琦公司）；TGL-18台式高速冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；ZEN3600激光粒度仪（英国Mar1vern公司）；H-600透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。

1.2 试药 α-细辛脑对照品（中国食品药品检定研究院，供含有量测定用，纯度100％，批号100298-201203）；α-细辛脑原料药（湖北康宝泰精细化工有限公司，纯度98.0％）。MPEG-PLGA（50∶50，分子量20 000，山东济南岱罡生物技术有限公司）；F68（德国BASF公司）；聚山梨酯80（国药集团化学试剂有限公司）。甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 表面修饰纳米粒的制备 采用纳米沉淀法制备纳米粒［9］，称取处方量的α-细辛脑和MPEG-PLGA，溶于适量丙酮中，形成有机相；取一定量的F68溶于水中，形成水相。在匀速搅拌条件下，将有机相缓慢加入到水相，40℃减压旋蒸，除去有机溶剂，0.45 μm微孔滤膜过滤，得到呈淡蓝色乳光的纳米粒胶体溶液。加入1％聚山梨酯80适量，匀速搅拌30 min，即得［10］。

2.2 HPLC分析方法建立

2.2.1 色谱条件［11］Agi1ent ZORBAX Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（70∶30）；检测波长257 nm；柱温35℃；流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取α-细辛脑对照品适量，甲醇溶解，配制成储备液。精密吸取适量，分别配制成502.50、251.25、50.25、20.10、10.05、5.03 μg/mL的对照品溶液，进样并记录峰面积。以各溶液质量浓度对峰面积进行线性回归，回归方程为Y=40.301X-0.041 7（r= 0.999 9），表明α-细辛脑在5.03～502.50 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度考察 取3种不同质量浓度的α-细辛脑对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD分别为0.08％、0.1％和0.14％，表明仪器精密度良好。

2.2.4 回收率测定 分别取3种浓度的α-细辛脑对照品溶液，加入空白纳米粒溶液，3 000 r/min离心30 min，测定超滤液中α-细辛脑的含有量。结果，回收率分别为98.21％、101.56％、99.41％，RSD分别为0.83％、1.01％、0.98％。

2.2.5 包封率和载药量的测定［12］采用超滤法测定包封率（EE）和载药量（DL）。取制备好的纳米粒胶束溶液0.5 mL，置于Mi11iPore超滤离心管中，3 000 r/min离心30 min。精密量取续滤液200 μL，甲醇定容至2 mL，再精密量取纳米粒胶束溶液200 μL，甲醇超声破乳。HPLC法测定游离α-细辛脑及总药物的浓度，按下式计算包封率和载药量。

包封率=［（总药量-游离药物量）/总药量］×100％；载药量=［（总药量-游离药物量）/纳米粒质量］×100％

2.3 优化设计

2.3.1 试验设计 在单因素试验的基础上，选取对α-细辛脑纳米粒制备影响较显著的3个因素，即有机相中载体材料MPEG-PLGA的质量浓度（X1）、MPEG-PLGA与药物的用量比（X2）和水相中F68的质量浓度（X3），进行优化研究。以α-细辛脑纳米粒的包封率（Y1）和载药量（Y2）为响应值，建立数学模型，优化制备工艺。实验因素水平表及实验设计结果见表1和表2。

表1　Bo x-Be h n k e n试验因素水平及编码

2.3.2 模型拟合 采用Design ExPert8.05实验设计软件，分别对Y1和Y2与各因素间的关系进行多元线性回归和二项式方程拟合。由拟合方程的复相关系数r值和P值可知，二项式方程拟合的效果较好，各因素对包封率和载药量均有影响，方差分析结果见表3和表4。多元线性回归方程为Y1=85.401 13 +0.741 00X1-0.834 50X2-1.579 17X3（r=0.634 1，P=0.003 6），Y2=20.794 51 +0.038 00X1-1.352 50X2-0.259 72X3（r=0.898 0，P＜0.000 1）；二项式方程为Y1=64.553 20 +3.146 42X1+3.141 10X2-9.097 31X3-0.010 200X1X2+0.243 89X1X3+0.360 00X2X3-0.129 86X21-0.284 64X22+1.081 48X23（r=0.907 9，P= 0.006 8），Y2=21.383 69 +1.044 07X1-2.846 19X2+ 0.108 92X3-0.010 800X1X2+0.036 667X1X3-0.105 56X2X3-0.048 270X21+0.114 52X22+0.025 617X23（r=0.979 2，P＜0.000 1）。

表2　Bo x-Be h n k e n试验设计及结果

表3　二项式回归模型显著性检验（包封率）

表4　二项式回归模型显著性检验（载药量）

2.3.3 效应面优化与预测 应用Design ExPert 8.05实验设计软件，绘制各因素对响应值的三维效应面，结果见图1。由图可知，α-细辛脑纳米粒的包封率Y1受X1、X2影响显著，随着MPEG-PLGA浓度的增加，包封率增加，而随着MPEG-PLGA与药物的用量比的增加，包封率下降；其载药量Y2受X2的影响最为显著，随着MPEG-PLGA与药物的用量比的增加，载药量降低，与单因素试验结果一致。然后，根据效应面选出各因素的最佳取值范围，得到最优工艺参数X1=11.35 mg/mL，X2=5，X3=0.2％，预测包封率Y1=90.68％，载药量Y2=15.04％。

2.4 工艺验证 根据优选的最佳工艺参数条件，制备3批样品，与模型预测值进行比较，结果见表5，发现各考察指标实测值与预测值的差异较小，偏差均在5％以内，表明该模型方程的预测性较好。同法制备3批未经聚山梨酯80修饰的纳米粒，测定其包封率为（84.35±2.01）％，载药量为（14.13±0.52）％，与聚山梨酯80修饰的纳米粒相比，两者均稍有下降。

表5　验证实验结果（n=3）

2.5 纳米粒形态观察 分别取聚山梨酯80修饰和未修饰的纳米粒胶束溶液适量，蒸馏水稀释，滴于铜网上，2％磷钨酸负染，15 min后透射电镜观察纳米粒形态，见图2。由图可知，纳米粒外观呈圆形，形状规则，外层有明显的亲水层。

2.6 粒径及分布、表面电位的测定 分别取聚山梨酯80修饰和未修饰的纳米粒胶束溶液适量，蒸馏水稀释，测定粒径大小、分布及Zeta电位，结果见图3和图4。由图可知，未经修饰纳米粒的平均粒径、分散指数和Zeta电位分别为（85.60±2.11）nm、0.105±0.020、（-21.6±1.7）mV，纳米粒的粒径较小，而且分布较窄，整个体系相对稳定；聚山梨酯80修饰纳米粒的平均粒径、分散指数和Zeta电位分别为（95.82±3.41）nm、0.148±0.030、（-26.4±2.1）mV，修饰后的纳米粒粒径稍有增大，分布均匀，电位绝对值增大，整个体系更加稳定。

图1　各因素与响应值的三维图

图2　未经修饰和经聚山梨酯8 0修饰纳米粒的透射电镜图（×20 000）

图3　未经修饰和经聚山梨酯8 0修饰纳米粒的粒径分布图

图4　未经修饰和经聚山梨酯8 0修饰纳米粒的电位分布图

3 讨论

为了提高α-细辛脑的生物利用度及脑靶向性，本实验采用可降解、生物相容性好的MPEG-PLGA作为长循环载体材料，制备了表面修饰的α-细辛脑纳米粒。由透射电镜图可以看出，纳米粒亲脂性内核的表面有明显的水化层，相关文献表明，这种水化层具备一定的位阻效应，从而逃避蛋白吸附和MPS吞噬，达到长循环的效果［13-14］。

本实验采用纳米沉淀法制备纳米粒，该方法是利用有机相与水相混溶时发生界面骚动与溶剂体系转换，使药物包裹在聚合物中并不断析出，从而形成纳米粒。载药量和包封率是评价纳米粒制备工艺的重要指标，两者越高，表明制备工艺越好，而且影响因素很多，如制备方法、载体浓度、水相与有机相的比例、载体与药物的用量比、表面活性剂的浓度、搅拌速度与温度等。在预实验的基础上，选择对纳米粒制备影响最显著的3个因素，即载体浓度、载体与药物的用量比和表面活性剂的浓度进行考察。结果，所制得纳米粒的包封率和载药量较高，粒径＜100 nm，并且分布均匀，适用于脑靶向给药［15］。

均匀设计和正交设计常用来优化工艺、筛选处方，由于采用线性数学模型进行拟合，故实验次数较少，但不能灵敏地考察各因素的交互影响，实验精密度不够理想，无法精确得到最佳点。而Box-Behnken效应面法可以弥补以上不足，采用非线性数学模型拟合，可以提高优化效果。

纳米粒包封率的测定方法有超速离心法、透析法、葡聚糖凝胶色谱法、超滤法等，目的均为将纳米粒与游离药物分离。本实验曾采用超速离心法，18 000 r/min离心1 h，发现纳米粒不能完全沉降，包封率测定结果比实际偏低，分析原因可能是所制备的纳米粒粒径较小，单纯依靠离心力不能有效地游离药物与纳米粒。因此，采用超滤离心法，在离心力的作用下，利用筛分原理对物质进行分离，从回收率试验结果可以看出，该方法准确度高、重现性好，而且操作简单、快速，适用于纳米粒的包封率测定。

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*通信作者:李 晔（1970—），女，博士，研究员，研究方向为中药新型给药系统。Te1:（029）87251837，E-mai1: 1iye1sj@163.com

作者简介:臧巧真（1991—），女，硕士，研究方向为中药新型给药系统。Te1:（029）87251837，E-mai1: zangqiaozhen@163.com

基金项目:陕西省重点科技创新团队计划项目（2012KCT-18）

收稿日期:2015-05-12

中图分类号:R944

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0456-05