九香虫对染锰雄性大鼠生殖损伤的保护

何志全， 张 莉， 凌 蕾， 孙志诚， 侯晓晖

（遵义医学院，贵州遵义563003）



九香虫对染锰雄性大鼠生殖损伤的保护

何志全， 张 莉， 凌 蕾， 孙志诚， 侯晓晖*

（遵义医学院，贵州遵义563003）

摘要:目的 探讨九香虫对生殖系统损伤的雄性大鼠生殖功能的保护作用。方法 将35只8周龄的雄性SD大鼠随机均分为5组，即模型组、空白组和九香虫高、中、低剂量干预组。除空白组外，其余大鼠给予腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O建立生殖损伤模型，九香虫组饲料含高、中、低剂量的九香虫，连续8周。观察和检测SD大鼠的生殖能力指标（性行为、大鼠精子数、睾丸和附睾的脏器系数、血清性激素水平）。结果 模型组的扑捉次数，射精能力，和精子数量较空白组和九香虫中、低剂量干预组明显下降；模型组睾丸、附睾脏器系数均显著低于空白组和九香虫高剂量干预组；模型组血清中睾酮水平均低于空白组和九香虫干预组，而黄体生成素水平则高于空白组和九香虫中剂量干预组。结论 中剂量的九香虫对生殖系统损伤的雄性大鼠生殖功能具有最佳保护功效果。

关键词:九香虫；锰染毒；生殖损伤；生殖保护

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.006

KEY W 0RDS: stik-bug（AsPongoPus chinensis）；exPosure to manganese；reProductive damage；reProductive Protection

九香虫为昆虫纲半翅目蝽科九香虫（AsPongo-Pus chinensis）的干燥全虫，主产于贵州、四川、云南等地，俗称“屁板虫”、“打屁虫”、“屁巴虫”。在民间，可作为中药昆虫和保健食品而广泛食用，具有很高的药用和食用价值，素有“有钱吃鹿茸，无钱吃打屁虫”和“吃了屁巴虫，滋补赛参茸，严冬不怕冷，夜间不尿床”等俗谚。《本草纲目》记载，该药“气味咸温、无毒，主治膈脘滞气、脾肾亏损、壮元阳”。《中国药典》也记载其“归肝脾肾经，功能理气止痛、温中助阳，用于胃寒胀痛、脾胃气痛、肾虚阳痿、腰膝酸痛”。研究证实［1-2］:九香虫含有多种维持人体正常生理功能所必须的氨基酸、脂肪酸、维生素，微量元素（Fe、Zn）等营养物质，具有抗菌抑菌等药理作用；其粗提物对于肝癌、胃癌细胞的体外生长亦有一定的抑制作用［3］；对治疗遗精、阳痿、肾炎、胃痛、痛经等有很好功效［4-9］。如此国药瑰宝，若能通过现代医学技术和方法证实其“温中助阳”的功能，必将为其进一步开发为药品或保健品提供实验数据支持。迄今为止，国内外对九香虫用于生殖系统损伤保护方面的研究尚未见报道，因此，本实验设计了九香虫干预生殖损伤实验，通过检测大鼠精子数、睾丸和附睾的脏器系数、血清性激素水平等指标反映九香虫对生殖损伤的保护作用和功能水平改善，通过性行为观察推断九香虫是否具有促进“温中助阳”功效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 清洁级SD大鼠，8周龄，体质量（200±10）g，雄性和雌性各35只，购于重庆第三军医大学动物实验室，许可证号: SCXK（渝）2012-0005。适养1周后用于实验。

1.1.2 主要试剂 九香虫若干（采自贵州省遵义市正安等县），MnC12·4H2O（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），NaC1（分析纯，上海化学试剂总厂），总蛋白定量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 饲料制备 九香虫饲料的制备:将购于遵义医学院动物实验中心的普通饲料磨成粉后，加入质量分数为20％、10％、5％的九香虫粉末，混匀，将其制成圆柱形，置于37℃烘箱中烘干，备用。

1.2 方法

1.2.1 染锰雄性大鼠生殖损伤模型建立 将35只雄性SD大鼠随机分为模型组、空白组和九香虫高、中、低剂量干预组，每组7只。通过腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O，1次/d，每周5 d，连续8周，空白组同样方式给予等量的生理盐水，通过锰染毒制备生殖损伤模型［10］。

1.2.2 九香虫干预实验 生殖损伤模型建立后第2周（即造模开始第9周）进行了九香虫干预实验，为保证每只大鼠的摄食量一致，采取单笼饲养，每日每只饲喂30 g饲料，九香虫高、中、低剂量干预组分别给予含九香虫20％、10％、5％的饲料喂养，模型组、空白组给予不含九香虫的饲料喂养，1次/d，7 d/周，连续8周。

1.2.3 生殖能力指标检测

1.2.3.1 性行为观察 发情雌鼠制备:通过手术方法，将35只雌性SD大鼠双侧卵巢切除，术后经肌肉注射青霉素2 U/d，连续3 d。饲养2周后进行实验，实验前48 h肌注苯甲酸雌二醇200 μg/kg，合笼前4 h肌注2 mg/kg黄体酮，以获得发情良好的雌鼠。

性行为观察:晚上7点开始观察，将雄性SD大鼠放入红色灯光下的透明盒10 min后，再将发情的雌鼠放入，观察到大鼠间互相接触、嗅舔、外生殖器探测等，之后出现扑捉和射精行为，每只雄性SD大鼠观察15 min。记录扑捉次数、骑跨次数、插入次数以及射精次数。

1.2.3.2 睾丸和附睾脏器系数 处死大鼠，摘取睾丸，迅速剥去周围脂肪组织和结缔组织后称重，并按下列公式计算睾丸脏器系数:睾丸脏器系数=（睾丸质量/体质量）×100％。附睾脏器系数计算方法同睾丸。

1.2.3.3 精子计数及每日精子生成量测定 精子计数:取大鼠一侧附睾，剪碎附睾尾，置于4 mL PBS缓冲液中，于37℃水浴箱中孵育15 min，制备精子混悬液，混匀，取出10 μL精子混悬液于另一盛有90 μL PBS的离心管中，混匀，取10 μL于血球细胞计数板上，在显微镜下数出5个中方格的总精子数n，则每mL精液中含有的精子数为n× 25/5×稀释倍数（10）×104。

每日精子生成量（dai1y sPerm Production，DSP）测定:取睾丸组织精确称重，移至加少量睾丸匀浆液（STM）匀浆管，在内切式组织匀浆器中匀浆，定容至25 mL。取10 μL匀浆液于血球计数板，在显微镜下数出5个中方格的总精子数n。每克睾丸中精子头数=n×25/5×STM稀释系数（25）×104÷组织质量；每日精子生成量=每克睾丸精子头计数÷大鼠精子发生所需时间（6.1 d）。

1.2.3.4 血清中性激素测定 用ELISA法，按照试剂盒说明书的操作方法检测各组雄性SD大鼠血清中的睾酮和黄体生成素。

2 结果

2.1 九香虫对SD大鼠性行为的影响 表1显示:空白组大鼠相对活跃，表现多动，兴奋，而模型组则精神萎靡不振、少动，两组之间的扑捉次数、骑跨次数、插入次数以及射精次数有显著性差异（P＜0.05），说明生殖系统损伤模型建立成功；九香虫干预组与模型组比较，中、低剂量组大鼠扑捉次数、骑跨次数、插入次数和射精次数明显增多，差异显著（P＜0.05），高剂量组的骑跨次数和插入次数明显增多（P＜0.05），而扑捉次数和射精次数没有显著差异。可推断饲喂一定剂量九香虫对大鼠有改善性行为的功效，但过量饲喂九香虫后改善功效出现下降趋势。

表1　各组间大鼠性行为的比较（±s，n=7）Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces（±s，n=7）

表1　各组间大鼠性行为的比较（±s，n=7）Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces（±s，n=7）

注:与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　　扑捉次数/次　　骑跨次数/次　　插入次数/次　　射精次数/次空白组81.67±13.32　38.33±5.51　32.00±1.73　30.00±3.46模型组　57.00±15.89*　20.60±4.04*　12.66±8.50*　14.42±8.22*九香虫高剂量干预组　70.63±9.32　32.67±7.23△　28.00±7.00△　18.00±8.83九香虫中剂量干预组　82.00±16.87△　33.80±8.58△　31.20±7.19△　28.00±9.31△九香虫低剂量干预组　74.88±11.53△　33.00±8.99△　30.43±8.90△　29.00±6.16△

2.2 各组大鼠睾丸脏器系数、附睾脏器系数 表2显示:模型组与空白组相比，脏器系数明显下降，有显著差异（P＜0.05），说明生殖系统损伤模型动物脏器发生了相应的萎缩。但九香虫干预后，与模型组比较，高剂量组大鼠体质量及睾丸、附睾脏器系数显著升高（P＜0.05），中剂量组体质量及睾丸脏器系数显著升高（P＜0.05），低剂量组睾丸脏器系数显著升高（P＜0.05）。可推断九香虫对大鼠的脏器有一定的保护功能，且与九香虫剂量有一定的正相关。

表2　各组大鼠睾丸脏器系数、附睾脏器系数的比较（x± s，n=7）Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent，epldldym ls（±s，n=7）

表2　各组大鼠睾丸脏器系数、附睾脏器系数的比较（x± s，n=7）Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent，epldldym ls（±s，n=7）

注:与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别　　体质量/g 睾丸脏器系数　附睾脏器系数空白组431.60±32.31 0.95±0.05 0.39±0.11模型组　380.11±22.67*0.81±0.09*0.29±0.03*九香虫高剂量干预组　423.10±52.08△0.96±0.04△　0.38±0.06△九香虫中剂量干预组　422.29±23.14△0.95±0.12△0.34±0.03九香虫低剂量干预组　407.74±28.43　 0.92±0.06△0.34±0.02

2.3 精子计数和每日精子生成量 表3显示:模型组与空白组比较，精子数量和DSP都显著下降（P＜0.05），说明生殖系统损伤模型大鼠精子发生出现了一定的障碍。九香虫干预后，与模型组比较，中、高剂量组大鼠精子数量和DSP明显增加（P＜0.05），低、中剂量组精子数显著增加（P＜0.05）。可推断九香虫有助于精子发生，且与九香虫剂量有一定的关联。

表3　各组大鼠精子数量和每日精子生成量的比较（±s，n=7）Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP（±s，n=7）

表3　各组大鼠精子数量和每日精子生成量的比较（±s，n=7）Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP（±s，n=7）

注:与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别　　精子数/ （107·mL-1）精子头计数/ （×106·g-1）每日精子生成量/ ［×106·（g·d）-1］2.47±0.50　 81.466±18.351　 13.355±3.008模型组　1.38±0.49*54.500±6.065*　8.934±0.994*九香虫高剂量干预组1.91±0.56　 73.302±17.676△12.017±2.898△九香虫中剂量干预组2.40±0.95△68.527±11.583△11.324±5.678△九香虫低剂量干预组2.32±0.55△64.368±13.637　 10.552±空白组2.236

2.4 血清性激素睾酮(T)和黄体生成素(LH)的含有量测定结果 表4显示:模型组与空白组相比，血清中的睾酮含有量降低，黄体生成素含有量升高，差异极显著（P＜0.01），与已有报道一致。九香虫干预组与模型组比较，血清中的睾酮水平升高，有显著差异（P＜0.05）；中剂量组黄体生成素含有量下降，有显著差异（P＜0.05），高、低

表4　各组大鼠血清睾酮和黄体生成素含有量测定结果的比较（±s，n=7）Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content（±s，n=7）

表4　各组大鼠血清睾酮和黄体生成素含有量测定结果的比较（±s，n=7）Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content（±s，n=7）

注:与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05

组别　　睾酮/（ng·L-1）　黄体生成素/（ng·L-1）空白组98.17±3.49　19.39±1.21模型组　90.43±2.69**　23.56±1.60**九香虫高剂量干预组　97.36±4.14△　20.82±2.43九香虫中剂量干预组　97.27±3.31△　20.01±2.48△九香虫低剂量干预组　97.08±4.33△21.94±0.96

剂量组无显著差异。说明一定剂量的九香虫有助于改善雄性大鼠的生精功能。

3 讨论

近年来，随着社会科技的发展、人们健康意识的加强及生殖医学的发展，锰与生殖健康的关系越来越受到关注。研究证实［10-11］，锰暴露能引起包括生精细胞凋亡、睾丸生长发育与成熟延迟、精液浓度和精子活率降低、生精功能障碍等生殖系统损伤。而九香虫在民间，可作为中药昆虫和保健食品而广泛食用，具有很高的药用和食用价值。研究也证实［1-2］，九香虫含有多种维持人体正常生理功能所必须的氨基酸、脂肪酸、维生素，微量元素（Fe、Zn）等营养物质，是人体所需的重要营养成分，具有抗菌抑菌等药理作用；其粗提物对于肝癌、胃癌细胞的体外生长亦有一定的抑制作用［3］，但对生殖系统损伤的生殖功能是否具有保护作用仍未得到证实。本实验从动物的性行为、大鼠精子数、睾丸和附睾的脏器系数、血清性激素水平等生殖能力指标来分析判断九香虫对生殖系统的保护功效。

本研究结果可知:九香虫干预生殖系统损伤的动物模型后，其大鼠相对活跃，表现多动，兴奋，与模型组相比，中、低剂量组的扑捉次数、骑跨次数、插入次数以及射精次数明显增多（P＜0.05），其表现接近于空白组。可推断九香虫有改善大鼠性行为的功效。脏器系数是指实验动物某脏器的质量与其体质量之比值。正常时各脏器与体质量的比值相对恒定，但动物染毒后随受损脏器质量改变脏器系数也发生改变。因此，脏器系数的变化可反映在环境因素影响下脏器的增生、充血、水肿或萎缩等变化，是毒理实验中常用的指标。表2结果显示:九香虫干预后，高剂量组的体质量及睾丸、附睾脏器系数均高于模型组（P＜0.05）。可推断九香虫对大鼠的脏器有一定的保护功能，且与九香虫剂量有一定的正相关。精子数量和DSP是研究环境因素对男（雄）性生殖健康影响的重要观察点之一，可有效判断生殖毒性。表3显示:九香虫干预后，与模型组比较，低、中剂量组的精子数明显增加（P＜0.05），中、高剂量组的精子头数和DSP明显增加（P＜0.05）。可推断九香虫有利于改善生精环境，有助于精子发生，且与九香虫剂量有一定的关联。血清中性激素水平是评价精子发生，了解睾丸组织结构特征的重要指标，可反映睾丸的生精功能。研究证实［12-13］:染锰可引起雄性动物血清中的睾酮含有量降低，黄体生成素含有量升高。我们实验结果也表明:模型组与空白组相比，血清中的睾酮含有量降低，黄体生成素含有量升高，差异极显著（P＜0.01），与已有报道一致。九香虫干预后，与模型组比较，血清中的睾酮含有量明显升高（P＜0.05）；中剂量组的黄体生成素明显下降（P＜0.05）。可推断九香虫有助于改善激素调控水平，增强雄性大鼠的生精功能。但实验结果同时也显示，部分实验数据出现高剂量组的保护效果不如低、中剂量组明显的现象，可能是高剂量并非最佳的给药剂量，九香虫剂量过多其保护作用可能下降。因此，善需进一步摸索九香虫的最佳保护剂量。

综上所述，九香虫干预生殖系统损伤的雄性大鼠后，其各项生殖能力指标均有较明显的改善，说明九香虫对生殖系统损伤的雄性大鼠生殖功能具有保护功效，且保护效果多以九香虫高、中剂量干预组效果最佳，但其保护的作用机制仍不清楚，还有待下一步继续研究。

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［临 床］

Protectlon of stlnk-bug on manganese-lnduced reproductlve damage to male rats

HE Zhi-quan， ZHANG Li， LIN Lei， SUN Zhi-cheng， HOU Xiao-hui*
（ZunyiMedical College，Zunyi563003，China）

ABSTRACT:AIM To investigate the Protective effect of stink-bug（AsPongoPus chinensis）on the manganeseinduced reProductive damages toma1e rats.METH0DS Thirty-fivema1e eightweeks o1d SD ratswere random1y divided into five grouPs（n =7）: the mode1grouP，the b1ank grouP and stink-bug high-，medium-and 1ow-dose intervention grouPs.ExcePt the b1ank grouP，the rest of rats received intraPeritonea11y MnC12·4H2O（15 mg/kg）to create reProductive damaged mode1 rats.Stink-bug grouPswere fed on the fodderwith stink-bug for eightweeks. The rats' reProductive caPacity indices，inc1uding sexy activity，sPerm count，the organ coefficientof testis and eP-ididymis，and serum sex hormone 1eve1weremeasured.RESULTS ComPared with the b1ank grouP and stink-bug medium-and 1ow-dose grouPs，sexua1 behavior indexes inc1uding caPturing times，ejacu1ation abi1ity，and sPerm count in themode1grouP were 1ower；comPared with the b1ank grouP and stink-bug high dose grouP，the coefficient of testis and ePididymis viscera in themode1grouP was a1so 1ower.The serum testosterone 1eve1s in themode1grouP were 1ower than those of the b1ank grouP and stink-bug grouPs（P＜0.05）.But1uteinizing hormone 1eve1was higher than that of the b1ank grouP and stink-bugmedium grouP.C0NCLUSI0N Themedium-dose stink-bug is the best choice in terms of rePairing the reProductive damages ofma1e rats.

*通信作者:侯晓晖（1980—），女，博士，教授，主要从事生物学研究。E-mai1: 330539793@qq.com

作者简介:何志全（1979—），男（瑶族），硕士，副教授，主要从事生殖发育研究。E-mai1: 17563239@qq.com

基金项目:贵州省“125计划”重大科技专项（黔教合重大专项字［2014］031）；贵州省中医药管理局基金（QZYY2011-65）；贵州省级大学生创新训练计划项目（201413653018）

收稿日期:2015-3-03

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0258-04