用HPLC法测定急扁颗粒中绿原酸和连翘苷的含量

刘彬果，任　涛，王　媛(解放军第二五四医院药剂科，天津 300142)



·论著·

用HPLC法测定急扁颗粒中绿原酸和连翘苷的含量

刘彬果，任涛，王媛(解放军第二五四医院药剂科，天津 300142)

[摘要]目的：建立HPLC法测定急扁颗粒中绿原酸和连翘苷含量。方法: Zorbax SB-C(18)色谱柱(150 mm×4．6 mm，5 μm)；以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为327 nm测定绿原酸含量；以乙腈-水(25∶75)为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为278 nm测定连翘苷的含量。结果: 绿原酸、连翘苷分别在6.24～199.6 μg/ml(r=0.999 9), 7.35～235.2 μg/ml(r=0.999 9)范围内线性良好，平均回收率分别为99.86%和98.30%(n=5)。结论：该方法快速、简便、准确、重复性好，结果可靠，可用于急扁颗粒中绿原酸和连翘苷的含量测定，为全面控制急扁颗粒的质量提供可靠方法。

[关键词]急扁颗粒；绿原酸；连翘苷；含量测定；色谱法，高效液相

[Pharm Care Res，2015，15(3): 193-195]

急扁颗粒为解放军第二五四医院多年的临床经验方，由金银花、连翘、桔梗、蒲公英四味中药组成，具有清热解毒的功效，临床适用于急、慢性扁桃腺炎，咽喉肿痛等症状。方中金银花性寒疏散，清热解毒兼可透散表邪；连翘性寒，清热解毒且升浮宣散，可清表里，与金银花相须为用，共为君药，这两味药发挥药效的主要成分为绿原酸和连翘苷[1]。关于中药制剂中绿原酸和连翘苷的含量测定方法已经有相关报道[1]。急扁颗粒为本院自制制剂，其现有的质量标准只有中药定性鉴别的方法，没有含量测定方法。为了更好地控制其质量，本研究采用HPLC法，以绿原酸和连翘苷作为指标成分进行含量测定。

1仪器和试药

Agilent 1260高效液相色谱仪、OpenLAB CDS色谱工作站、Zorbax SB-C18色谱柱(150 mm×4．6 mm，5 μm)色谱柱(美国Agilent公司)；XS十万分之一电子天平(瑞士梅特勒集团)。绿原酸对照品(纯度 96.6%，批号 110753-201314)、连翘苷对照品(纯度 96.8%，批号 110821-201112)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。急扁颗粒由本院制剂室提供(批号13170135、13400137、14040115)。

2方法和结果

2.1色谱条件(1)绿原酸流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：327 nm，进样量：10 μl。理论塔板数按绿原酸峰计算≥2000。(2)连翘苷流动相：乙腈-水(25∶75)；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：278 nm，进样量：10 μl。理论塔板数按连翘苷峰计算≥3000。

2.2对照品溶液的制备(1)绿原酸对照品溶液精密称取绿原酸对照品4.99 mg，置于25 ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，制成绿原酸对照品储备液(199.6 μg/ml)。(2)连翘苷对照品溶液精密称取连翘苷对照品5.88 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇制成连翘苷对照品储备液(235.2 μg/ml)。

2.3供试品溶液的制备(1)绿原酸供试品溶液取急扁颗粒约0.5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得绿原酸供试品溶液[2,3]。(2)连翘苷供试品溶液取急扁颗粒约4.0 g，余步骤同2.3项(1)。精密量取续滤液20 ml，蒸干，残渣用70%乙醇10 ml溶解，加在中性氧化铝柱(100～120目，6.0 g，内径1 cm)上，用70%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干。残渣加适量50%甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得连翘苷供试品溶液[3,4]。

2.4阴性对照溶液的制备按照处方组成比例，分别制备不含金银花、蒲公英和连翘药材的阴性样品，并按供试品溶液制备方法分别制备阴性对照溶液。

图1　绿原酸的HPLC谱图Figure 1　HPLC photograms of chlorogenic acidA：对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性对照溶液；1：绿原酸

图2　连翘苷的HPLC谱图Figure 2　HPLC photograms of forsythinA：对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性对照溶液；1：连翘苷

2.5专属性实验分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液5 μl，注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件分别进行测定，记录色谱图(见图1与图2)。结果显示，在与对照品相同保留时间处无色谱峰，说明本品中的其他成分对测定无干扰。2.6线性关系的考察精密量取绿原酸对照品储备液制成浓度为6.24、12.48、24.95、49.9、99.8、199.6 μg/ml的系列对照品溶液；精密称取连翘苷对照品储备液制成浓度为7.35、14.7、29.4、58.8、117.6、235.2 μg/ml的溶液。按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，以进样量(c)为横坐标，相应的峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线,绿原酸：A1=522.3c1-30.34，r=0.999 9(n=6)；连翘苷：A2=6 880.1c2-1.799，r=0.999 9(n=6)。结果表明，绿原酸和连翘苷分别在6.24～199.6 μg/ml和7.35～235.2 μg/ml范围内线性关系良好。

2.7精密度实验分别精密吸取绿原酸和连翘苷的同一对照品溶液，按2.1项下色谱条件分别测定，连续进样6次，记录峰面积的RSD值分别为 0.35%和0.26%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.8稳定性实验分别吸取绿原酸、连翘苷的供试品溶液在室温下放置不同时间(0、1、4、8、10、12、24 h)，分别测定，其峰面积RSD值分别为 1.32%和1.89%(n=7)，结果表明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.9重复性实验按2.3项下方法,对同一批(批号13400137)样品分别平行制备绿原酸、连翘苷样品溶液各6份,分别测定其含量。结果绿原酸、连翘苷平均含量分别为3.62 mg/g和0.375 mg/g，RSD值分别为0.86%和1.24%(n=6)，表明分析方法重复性较好。

2.10加样回收率实验取已知含量的同一批号(批号13400137)的样品5份,研细，精密称取，分别精密加入定量的绿原酸和连翘苷对照品溶液,按2.3项下方法制备绿原酸和连翘苷供试品溶液,并按2.1项下色谱条件分别测定，结果见表1。

表1　绿原酸和连翘苷的加样回收率实验结果

2.11样品含量测定取批号为13170135、13400137、14040115的样品，按2.3项下方法分别制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，外标法定量，计算3个批次的样品中绿原酸和连翘苷的含量。结果绿原酸含量分别为34.5、36.3、37.2 mg/g，连翘苷含量分别为0.345、0.367、0.388 mg/g。

3讨论

3.1提取方法的选择在预实验中，作者对同一样品分别采用50%甲醇、70%乙醇为溶剂，以超声提取、回流提取来制备绿原酸样品溶液，结果显示，采用50%甲醇超声提取绿原酸较完全，且该方法操作简单，便于实际操作。在研究连翘苷的提取方法时，根据药典方法，采用50%甲醇提取，上中性氧化铝柱，分离纯化效果较好。

3.2检测波长的选择采用紫外全波长扫描，绿原酸对照品溶液及供试品溶液在327 nm处有最大吸收。连翘苷对照品溶液和供试品溶液在278 nm处有最大吸收，灵敏度高，所以选择在327 nm处检测绿原酸，在278 nm处检测连翘苷。

3.3流动相的选择金银花中的有效成分为绿原酸和异绿原酸等。它们的化学结构相似，分离难度大，采用HPLC法测定时，容易出现肩峰。按《中华人民共和国药典》2010年版方法，分别采用不同比例乙腈-0.4%磷酸进行测定，结果显示峰形较好的流动相比例为乙腈-0.4%磷酸(11∶89)，在此比例的流动相条件下，可以有效改善峰形，分离效果明显。

【参考文献】

[1]张作平，黄伟，尹建伟，等. HPLC法测定小儿银牛颗粒中绿原酸的含量[J]. 中药新药与临床药理，2009,20(6):560-562.

Zhang ZuoPing，Huang Wei，Yin JianWei，etal. Determination of chlorogenic acid in Xiao’er Yinniu granules by HPLC[J].Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol,2009,20(6):560-562.In Chinese with English abstract.

[2]崔佳，吴芳，鲁燕侠，等.HPLC法测定感咳清颗粒中绿原酸的含量[J].中国新药杂志，2008,17(10):878-880.

Cui Jia,Wu Fang,Lu YanXia,etal.Determination of chlorogenic acid in Gankeqing granules by HPLC[J].Chin J New Drugs,2008,17(10):878-880.In Chinese with English abstract.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010年版 一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:159，205，206.

State Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010 ed.Volume 1[S].Beijing:Chinese Medical Science Press,2010:159,205,206.In Chinese.

[4]张锦，毛庆，郑小平，等. RP-HPLC法测定小儿感冒颗粒中连翘苷的含量[J].药物分析杂志,2007,27(7):1065-1067.

Zhang Jin，Mao Qing，Zheng XiaoPing，etal. RP-HPLC determination of forsythin in Xiao’er Ganmao granules[J].Chin J Pharm Anal, 2007,27(7):1065-1067.In Chinese with English abstract.

[修回日期]2015-01-04

[本文编辑]阳凌燕

Content determination of chlorogenic acid and forsythin in Jibian granules by HPLC method

LIU BinGuo,REN Tao,WANG Yuan

(Department of Pharmacy,No.254 Hospital of PLA, Tianjin 300142,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC method for content determination of chlorogenic acid and forsythin in Jibian granules. Methods: The analysis was performed on Zorbax SB-C(18) column(150 mm×4.6 mm，5 μm).Chlorogenic acid was eluted by acetonitrile-0.4% phosphoric acid (11∶89) as the mobile phase and the flow rate was 1.0 ml/min.The detection wavelength was 327 nm. Forsythin was eluted by acetonitrile-water(25∶75) at a flow rate of 1.0 ml/min,and the detection wavelength was 278 nm.Results: The linear range of chlorogenic acid and forsythin was 6.24-199.6,7.35-235.2 μg/ml(r=0.999 9),and the average recoveries were 99.86% and 98.30% (n=5),respectively. Conclusion:This method is simple，accurate，reproducible and reliable. It is suitable for the content determination of chlorogenic acid and forsythin in Jibian granules and the quality control of Jibian granules as well.

[KEY WORDS]Jibian granules;chlorogenic acid;forsythin;content determination;chromatography,high performance liquid

[收稿日期]2014-07-09

DOI：10.5428/pcar20150311

[中图分类号]R927.2

[文献标志码]A

[文章编号]1671-2838(2015)03-0193-03

作者简介刘彬果(女)，博士，主管药师.E-mail：lbg991227@163.com

基金项目总后勤部专项课题(14ZJZ01)