HPLC法测定华佗豆中绿原酸的含量

李兵++曾艳婷++莫惠雯++陈圣斌++赵惠玲++卢汝梅

【摘要】目的：建立华佗豆中绿原酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法测定华佗豆中绿原酸的含量，液相色谱柱为Inertsil ODS-3 （250mm×46mm，5μm），流动相为乙腈和01%磷酸水溶液，流速1mL/min，检测波长327nm。结果：绿原酸进样量在0548～3288μg之间线性关系良好（r=09999）；华佗豆中绿原酸平均回收率为9631%。结论：该方法简便、灵敏、准确性高，重复性好，为华佗豆的质量标准制定及进一步研究提供参考依据。

【关键词】华佗豆；绿原酸；HPLC

【中图分类号】R914【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）01-0016-03

Determination of Chlorogenic Acid in Plants of Calonyction muricatum by HPLC

LI BingZENG YantingMO HuiwenCHEN ShengbinLU Rumei*

Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200，China

Abstract：Objective To develop a HPLC method for the determination of chlorogenic acid（CHA） from Calonyction muricatum. Methods CHA was determined by HPLC on a Inertsil ODS-3（250mm×46mm，5μm） column， acetonitrile-01% phosphoric acid solution as mobile phase， the flow rate was 10mL/min and detected at 327nm. Results Good linearities of CHA in the range of 0548～3288ug（r=09999）. And the average recovery was 9631%（RSD=212%）. Conclusion These results as above was simple，sensitive，accurate and had good reproducibility， can be used to provide the scientific evidence for the establishment of standard for quality controland further study.

Keywords：Calonyction muricatum； Chlorogenic Acid； HPLC

华佗豆为旋花科植物丁香茄Calonyction muricatum （Linn） GDon的种子，又名天茄子、天茄。其始载于《救荒本草》，味苦，性寒，具有泻下、解毒等功效，分布于广西、云南、河南、湖北、湖南等地[1]。在广西民间，华佗豆又称跌打豆，常用于治疗跌打损伤、小儿疳积、小儿肺炎，疗效显著[2]。Gevara B Q等[3]研究结果表明，华佗豆具有明显的镇痛、镇静、抗菌活性。华佗豆中富含绿原酸成分，绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸缩合而成的缩酚酸，具有抗菌、增高白血球、清除自由基、抑制黄嘌呤氧化酶等活性[4]。绿原酸为抗菌抗炎作用的酚酸类活性成分。目前，以绿原酸类成分用于华佗豆质量控制的报道较少，研究采用HPLC法测定华佗豆中绿原酸的含量，为其质量控制和临床开发应用提供科学依据。

1仪器与材料

11仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BS224分析天平（德国赛多利斯）；KQ-500DA数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；CD-UPH-II-20L实验室超纯水器（成都超纯科技有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭）。

12材料綠原酸（批号：F9MQ-ADLM，中国食品药品检定研究院）；甲醇（批号：67-56-1）、乙腈（批号：75-05-8）均为色谱纯，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；水为超纯水。

华佗豆药材采自玉林市，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为旋花科植物丁香茄Calonyction muricatum （Linn） GDon的种子 。

2方法与结果

21色谱条件Inertsil ODS-3柱（46mm×250mm，5μm），以乙腈（B）-01%磷酸水溶液（A）（9 ∶[KG-*3]91）为流动相；流速1mL/min；柱温25℃；检测波长327nm；进样量5μL。

22对照品溶液制备取绿原酸对照品约14mg，精密称定，加甲醇定容到25mL量瓶中，制成每1mL含0548mg绿原酸的溶液，即为对照品溶液。

23供试品溶液的制备取华佗豆（玉林）粉末（过号筛）约03g，精密称定，置50mL锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定质量，常温下超声处理90min，冷却至室温，用甲醇补足质量，摇匀，滤过，取适量续滤液经，高速离心15min，作为供试品溶液。

24线性范围考察精密吸取绿原酸对照品溶液1、2、3、4、5、6μL，依次进样，测定绿原酸的峰面积。以峰面积对进样量（μg）进行直线回归，得回归方程为：Y=140608965X-03327，r=09999。结果表明： 绿原酸在0548～3288μg 范围内呈良好的线性关系。

25精密度试验取上述对照品溶液，按“21”项下色谱条件连续进样6次，测定绿原酸的峰面积。结果绿原酸峰面积RSD为0 99 %，表明仪器精密度良好。

26稳定性试验取同一份供试品（玉林），按“23”项下方法制备，按“21”项色谱条件分别在0、3、6、12、18、24h进样，测定绿原酸峰面积，RSD为112%，表明供试品溶液在24h内稳定。

27重复性试验取同一份供试品（玉林），按“23”项下方法平行制备6份，按21项色谱条件进样，结果绿原酸平均含量为1456mg/g，RSD为274%，表明本法重复性良好。

28加样回收试验精密称取已知绿原酸含量的华佗豆样品015g，共6份，分别精密加入1866mg/mL绿原酸对照品1mL，按“23”项下方法制备，按“21”项色谱条件分别测定，计算加样回收率，平均加样回收率为9631%，RSD为212%，结果表明本法准确度良好。结果见表1。

29样品含量测定取4个不同产地华佗豆药材粉末03g，精密称定，按“23”项下方法制备，按“21”项色谱条件分别测定。结果见表2，图1、2。

3讨论

绿原酸为苯丙素类化合物，分子结构中含有酯基、不饱和双键及多元酚，邻二酚羟基在加热过程中易氧化分解，故本研究采用甲醇常温下超声处理。不同产地华佗豆含量测定结果表明，华佗豆中含有大量的绿原酸类成分，基于此类成分与其抗菌抗炎活性息息相关，可考虑将此类成分的含量作为华佗豆的质量控制指标。本研究中建立的含量测定方法简单可行，重现性好，可为华佗豆药材的质量控制提供参考。

参考文献

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第6卷）[M].上海：上海科学技术出版社，1999： 495.

[2] 朱小勇，赵红艳，黄贵庆，等.超临界CO2提取天茄子挥发油化学成分的分析[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：139-141.

[3] Guevara B Q，Rosalinda C，Solevilla Y B，et al.Preliminary phytochemical microbiological and pharmacological studies of Calonyction muricatum Linn[J]. Acta Manilana Ser A Nat Appl Sci，1978，（17）：20.

[4] 徐小昆， 陳志勇， 廖立平， 等. 丁公藤属植物中东莨菪苷、绿原酸、东莨菪素、异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 的含量测定[J].中国中药杂志，2015，40（6）：1119-1122.

（编辑：穆丽华）