用GC-MS法测定大鼠血浆中1,8-桉树脑的浓度及其药动学研究

辜雪琴,齐　天，曲丽萍，范国荣*,亓云鹏,*

[1. 福建中医药大学药学院，福州 350122；2. 第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433]



·论著·

用GC-MS法测定大鼠血浆中1,8-桉树脑的浓度及其药动学研究

辜雪琴1,齐天2，曲丽萍2，范国荣2*,亓云鹏1,2*

[1. 福建中医药大学药学院，福州 350122；2. 第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433]

[摘要]目的：建立大鼠血浆样品中1,8-桉树脑的定量分析方法，并测定其在大鼠体内的药动学参数。方法：以α-蒎烯为内标，采用GC-MS法，选择离子模式(m/z 93)，建立大鼠血浆中1,8-桉树脑的定量分析方法，并测定大鼠灌胃1,8-桉树脑200 mg/kg后的药动学参数。结果：1,8-桉树脑与内标保留时间分别为3.13和3.91 min；1,8-桉树脑经大鼠灌胃给药后的主要药动学参数如下：t(max)为(0.75±0.16) h，c(max)为(26.55±3.73) μg/ml，t(1/2)为(1.92±0.60) h，MRT为(3.22±0.97) h，AUC(0～12 h)为(88.22±3.96) μg·h·ml(-1)，AUC(0～∞)为(91.24±4.13) μg·h·ml(-1)。结论：本方法灵敏度高、操作简单，可用于大鼠血浆中1,8-桉树脑的含量测定及药动学研究。

[关键词]1,8-桉树脑；药代动力学；气相色谱-质谱法；α-蒎烯

[Pharm Care Res，2015，15(3): 189-192]

1,8-桉树脑(1,8-cineole)，又名桉叶油素(eucalyptol)，具有樟脑和清凉的草药气味，广泛存在于桉叶油等270多种天然精油中。现代药理学研究表明，1,8-桉树脑具有明确的抗炎作用，可抑制炎症介质的产生[1]，缓解硝基苯诱导的结肠炎[2]，对内毒素血症小鼠肝衰竭有保护作用[3]，对血管、肠平滑肌有松弛作用[4]等。目前，对于1,8-桉树脑这一有效抗炎单体尚未开展系统的药动学研究。考虑到1,8-桉树脑具有挥发性，本研究拟采用GC-MS联用技术，建立大鼠血浆样品中1,8-桉树脑的定量分析方法，并将其用于1,8-桉树脑在大鼠体内的药动学研究。

1仪器和试药

1.1仪器GC-MS联用仪(包括AS3000自动进样器、气相色谱仪、ITQ1100质谱仪和Xcalibur2.0工作站)和CR3i台式高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔公司)；高纯氦(99.999%，上海都茂爱净化气有限公司)；HA-202M电子天平(日本A&D公司)。

1.2药品和试剂1,8-桉树脑对照品(纯度>99%)和α-蒎烯(纯度>98%)均为大连美仑生物技术有限公司提供；乙酸乙酯(色谱纯，美国Tedia公司)；肝素钠(上海第一生化药业有限公司，批号 130301)。

1.3实验动物SD大鼠，雌雄各半，体重约180 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证编号：SCXK(沪)2012-0002。

2方法和结果

2.1色谱条件GL-5 MS毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，固定液：5%苯基+95%二甲基聚硅氧烷)。程序升温：起始温度为70 ℃，15 ℃/min升至130 ℃，保持0.5 min，30 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。进样量：1 μl，分流比：30∶1，柱流量：1 ml/min。进样口温度：250 ℃，传输线温度：250 ℃，离子源温度：220 ℃， EI源：70 eV；溶剂延迟时间：2 min。采用选择离子模式(SIM)：2～5 min采集m/z93(1,8-桉树脑及内标)，内标为α-蒎烯。

2.2溶液的配制

2.2.11,8-桉树脑对照品溶液及其内标溶液的配制精密称取1,8-桉树脑对照品25.7 mg置25 ml量瓶中，加乙酸乙酯定容，得浓度为1.028 mg/ml的1,8-桉树脑对照品储备液，临用时用乙酸乙酯稀释成相应的浓度。称取内标α-蒎烯25.0 mg，用乙酸乙酯溶解，制得浓度为1.0 mg/ml的α-蒎烯对照品储备液，用乙酸乙酯稀释后制得浓度为10 μg/ml的α-蒎烯内标溶液。

2.2.2大鼠灌胃用溶液的配制精密称取1,8-桉树脑对照品500.0 mg，加入2%的吐温80无菌注射用水25 ml，制得浓度为20.0 mg/ml的1,8-桉树脑混悬液。

2.3给药方案，血浆样品采集及前处理SD大鼠6只，雌雄各半，禁食12 h过夜。按200 mg/kg灌胃1,8-桉树脑对照品溶液，分别于给药后10、20、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h眼眶取血0.5 ml，置于1.5 ml涂有肝素钠的EP管中，上下振摇3次，6×103×g离心10 min，取上清液，置-20 ℃冰箱中保存待用。取大鼠血浆样品100 μl，置5 ml玻璃离心管中，加入10 μl浓度为10 μg/ml的α-蒎烯内标溶液，涡旋混合1 min后，加入200 μl乙酸乙酯，涡旋3 min，1.5×103×g离心10 min。取180 μl上清液于进样瓶中，用GC-MS分析，内标法定量。

2.4方法学考察

2.4.1方法特异性研究在上述研究条件下，1,8-桉树脑和α-蒎烯与血浆中内源性物质分离完全，内源性物质不干扰分离分析，两药保留时间分别为3.13和3.91 min，色谱图见图1。信噪比(S/N)>10时1,8-桉树脑最低定量浓度为0.102 8 μg/ml，RSD值为9.70%。

2.4.2标准曲线和定量限取空白血浆90 μl，精密加入1,8-桉树脑对照品溶液10 μl，涡旋混匀，配成含1,8-桉树脑浓度为0.102 8、0.205 6、0.514 0、1.028、2.056、5.14、10.28 μg/ml的含药血浆，按照2.3项下方法操作，进样分析，记录色谱图。以待测物浓度(X)为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，求得1,8-桉树脑回归方程：Y=0.602 8X-0.024 0(r=0.998 7)。结果表明，1,8-桉树脑在0.102 8～10.28 μg/ml浓度范围内线性良好。

图1　大鼠血浆中1,8-桉树脑和内标α-蒎烯的GC-MS谱图Figure 1　GC-MS photograms of 1,8-cineole and the internal standard α-pinene in the plasma of ratsA：空白血浆；B：空白血浆+1,8-桉树脑+内标α-蒎烯；C：给药后大鼠血浆样品；1:1,8-桉树脑；2:α-蒎烯

2.4.3精密度和准确度实验制备1,8-桉树脑浓度分别为0.205 6、1.028、8.224 μg/ml的低、中、高浓度对照品血浆，每个浓度5份，按2.3项下方法处理后，于1 d内5个不同时间点测定，连续3 d。将待测物峰面积与内标峰面积的比值代入当天的随行标准曲线求得实测浓度，计算日内、日间精密度与准确度。结果日内、日间RSD均<15% (见表1)。准确度以方法回收率表示，同法制备低、中、高浓度对照品血浆样品各5份，按照2.3项下方法处理后进样分析，记录色谱峰面积，计算待测物峰面积与内标峰面积的比值，代入标准曲线方程，计算实测浓度与加入浓度的比值即为方法回收率。结果见表1。

表1　精密度和准确度实验结果

2.4.4提取回收率和基质效应同法制备低、中、高浓度对照品血浆样品各5份，按2.3项下方法处理后进样分析，得峰面积作为Set 1。用乙酸乙酯提取空白血浆，基质残渣用相应浓度对照品溶液复溶，使之浓度与Set 1待测理论浓度一致，每个浓度平行操作5份，离心后取上清液进行分析得峰面积作为Set 2。将对照品溶液用乙酸乙酯稀释，使之与Set 1待测理论浓度一致，每个浓度平行制备3份，进样分析得峰面积作为Set 3。通过Set 1与Set 3中1,8-桉树脑峰面积均值的比值求得1,8-桉树脑的提取回收率，以Set 2与Set 3中1,8-桉树脑峰面积均值的比值来评价基质效应。结果表明，血浆样品中1,8-桉树脑的提取回收率>90%，且生物基质基本稳定，通过随行标准曲线校正，生物基质不影响样品的测定(见表2)。

表2提取回收率和基质效应实验结果

Table 2Results of extraction recovery

and matrix effect tests

浓度(ρB/μg·ml-1)提取回收率基质效应0.205693.69±2.79107.19±2.391.02899.03±3.71101.78±1.438.22491.29±2.71103.59±2.03

2.4.5稳定性实验同法制备低、中、高浓度对照品血浆样品，考察室温(25 ℃)放置3 h、冻融循环3次后提取、提取后在自动进样器上放置24 h的稳定性。以测得的1,8-桉树脑与内标峰面积比值与其平均初始比值比较，以两者的相对误差来评价稳定性。结果表明，血浆样品处理后在上述条件下均稳定，RSD均<9%(n=3)。

2.5血样测定按2.3项下方法采集血样，测定6只SD大鼠灌胃给药后各个时间点的血药浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线，见图2。药动学参数采用BAPP 3.1软件以非房室模型进行分析， 得到药动学参数如下：tmax为(0.75±0.16) h，cmax为(26.55±3.73) μg/ml，t1/2为(1.92±0.60) h，MRT为(3.22±0.97) h，AUC0～12 h为(88.22±3.96) μg·h·ml-1，AUC0～∞为(91.24±4.13) μg·h·ml-1。

图2　1,8-桉树脑的平均血药浓度-时间曲线Figure 2　The mean drug concentration-time curve of 1,8-cineole

3讨论

文献报道50～400 mg/kg为1,8-桉树脑发挥抗炎作用的有效口服剂量[5]，因此本研究的给药剂量确定为200 mg/kg。考虑到α-蒎烯与1,8-桉树脑结构类似，故本研究选用α-蒎烯为内标，两者保留时间相差不大，缩短了分析时间。

在优化GC-MS分析条件时，采用选择离子模式(SIM)进行定量，根据定量离子应选择质荷比相对较大、离子丰度相对较高的原则，1,8-桉树脑的基峰为m/z43，不适合选为定量离子，而m/z93是 1,8-桉树脑丰度较高的离子，也是内标α-蒎烯的基峰。因此采用SIM(m/z93)进行定量分析，1,8-桉树脑及内标峰两者分离完全，峰形良好，提高了分析方法的准确性及灵敏度。与目前文献报道方法比较[6]，本研究建立的GC-MS方法，样品前处理采用乙酸乙酯进行提取，方法简单；GC-MS分析样品的时间短，总运行时间为11.5 min；且通过SIM进行检测分析，方法的专属性好。

本研究建立了GC-MS法测定1,8-桉树脑在SD大鼠体内的血药浓度，专属性好，血浆内源性物质对1,8-桉树脑及内标α-蒎烯的测定无干扰，血浆样品中1,8-桉树脑的线性、准确度、精密度及稳定性均符合生物样品的分析要求。将该方法运用于1,8-桉树脑大鼠体内药动学研究，结果表明，1,8-桉树脑口服吸收较快，且在大鼠体内消除较快。相关文献表明，1,8-桉树脑具有很强的渗透性[7]，可开发为透皮吸收给药制剂，作为局部抗炎、抗菌药物使用。本研究为含有1,8-桉树脑的挥发油的药动学研究、新药研究的代谢筛选和临床用药的疗效评价提供了重要依据。

【参考文献】

[1]Lima P R,de Melo T S,Carvalho K M,etal. 1,8-Cineole (eucalyptol) ameliorates cerulein-induced acute pancreatitisviamodulation of cytokines, oxidative stress and NF-κB activity in mice[J]. Life Sci,2013, 92(24-26):1195-1201.

[2]Santos F A, Silva R M, Campos A R,etal. 1,8-Cineole (eucalyptol), a monoterpene oxide attenuates the colonic damage in rats on acute TNBS-colitis[J]. Food Chem Toxicol, 2004, 42(4):579-584.

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[4]Lahlou S,Figueiredo A F,Magalhães P J,etal.Cardiovascular effects of 1,8-cineole, a terpenoid oxide present in many plant essential oils, in normotensive rats[J].Can J Physiol Pharmacol,2002,80(12):1125-1131.

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[6]戴玮,肖苏萍,郭凯,等.GC测定苗药大果木姜子中1,8-桉叶素的含量[J].中国现代中药,2013,15(9):741-743.

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[7]de Sousa J P,Torres Rde A,de Azerêdo G A,etal.Carvacrol and 1,8-cineole alone or in combination at sublethal concentrations induce changes in the cell morphology and membrane permeability ofPseudomonasfluorescensin a vegetable-based broth[J].Int J Food Microbiol,2012,158(1):9-13.

[修回日期]2015-05-07

[本文编辑]阳凌燕

Concentration determination of 1,8-cineole in rat plasma by GC-MS method and its pharmacokinetics study

GU XueQin1,QI Tian2,QU LiPing2,FAN GuoRong2*,QI YunPeng1,2*

[1.School of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China；2.Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical (Chinese Materia Medica) Metabolites Research,Shanghai 200433,China]

[ABSTRACT]Objective: To establish the quantitative analysis method of 1,8-cineole in rat plasma and determine its pharmacokinetic parameters in vivo. Methods: Quantitative analysis method for 1,8-cineole in rat plasma was established by using GC-MS, with selected ion mode (m/z 93) and α-pinene as internal standard. Pharmacokinetic parameters of 1,8-cineole were studied after gavage 200 mg/kg to the rats. Results: Retention time for 1,8-cineole and internal standard α-pinene were 3.13 and 3.91 min, respectively. The main pharmacokinetic parameters of 1,8-cineole after gavage were as follows: t(max) (0.75±0.16) h,c(max) (26.55±3.73) μg/ml,t(1/2) (1.92±0.60) h,MRT (3.22±0.97) h,AUC(0-12 h) (88.22±3.96) μg·h·ml(-1) and AUC(0-∞) (91.24±4.13) μg·h·ml(-1).Conclusion: The proposed method is sensitive and simple,and could be used for the determination and pharmacokinetics study of 1,8-cineole.

[KEY WORDS]1,8-cineole;pharmacokinetics;gas chromatography-mass spectrometry;α-pinene

[收稿日期]2014-12-09

DOI：10.5428/pcar20150310

[中图分类号]R927.2，R969.1

[文献标志码]A

[文章编号]1671-2838(2015)03-0189-04

作者简介辜雪琴(女)，硕士生.E-mail: guxueqin0906@163.com*通信作者(Corresponding author)：亓云鹏，E-mail：qiyunpeng@hotmail.com；范国荣，E-mail：guorfan@outlook.com

基金项目国家自然科学基金(81173019)，第二军医大学药学院“时珍学者培养计划”资助项目