用HPLC法测定珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量

陈方剑，陆松伟，宋洪杰，高鸿彬，全山丛，骆锦前 (第二军医大学长海医院药学部，上海 200433)



·论著·

用HPLC法测定珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量

陈方剑，陆松伟，宋洪杰*，高鸿彬，全山丛，骆锦前 (第二军医大学长海医院药学部，上海 200433)

[摘要]目的：建立HPLC法测定珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E的含量。方法：维生素B6：Kromasil C(18)色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流 动 相：甲醇-0.04%庚烷磺酸钠(用冰乙酸调节pH至3.0)=20∶80；检测波长：291 nm。维生素E：ACE-121-1546 C(18)色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水=95∶5，检测波长：285 nm。流速：1.0 ml/min；柱温：室温。结果：维生素B6在5.000 5～100.01 μg/ml范围内线性关系良好(r=1.000 0)，低、中、高浓度(标示量80%、100%、120%)的平均回收率分别为(97.46±1.30)%、(99.00±0.34)%、(98.09±0.56)%(n=3)。维生素E在31.96～255.68 μg/ml范围内线性关系良好(r=0.999 9)，低、中、高浓度(标示量80%、100%、120%)的平均回收率分别为(100.04±1.57)%、(100.02±0.30)%、(102.92±0.56)%(n=3)。精密度、重现性和稳定性良好。结论：该方法准确、灵敏，专属性强，重现性好，对珍珠维E乳膏质量控制标准的提高具有参考意义。

[关键词]珍珠维E乳膏；维生素B6；维生素E；含量测定；色谱法，高效液相

[Pharm Care Res，2015，15(3): 201-204]

珍珠维E乳膏是由尿素、维生素B6、维生素E、人参、川芎等制成的院内特色制剂，在第二军医大学长海医院皮肤科临床使用多年，主治黄褐斑、雀斑、老年斑及日晒斑等皮肤病，疗效显著。珍珠维E乳膏原有的质量标准仅测定尿素含量，对反映药效的维生素B6和维生素E 未建立质控方法。本研究建立测定珍珠维E乳膏中维生素B6和维生素E含量的HPLC法，为提高其质量控制标准提供参考。

1材料

1.1仪器LC-10ADVP高效液相色谱仪，包括LC-20AD泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、CBM-20A控制器和LC solution工作站(日本岛津公司)；XS205DU十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；DL-720A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。

1.2试剂和药品珍珠维E乳膏(第二军医大学长海医院药学部自制，批号131008、131104、131105)；维生素B6对照品(纯度99.6%，大丰海嘉诺药业有限公司，批号1205202)；维生素E对照品(纯度97.0%，浙江医药股份有限公司，批号110405)；庚烷磺酸钠(东京化成工业株式会社)；甲醇[色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；无水乙醇(江苏省常熟市杨园化工有限公司)、冰乙酸[永华化学科技(江苏)有限公司]均为分析纯；水为蒸馏水(本院药学部自制)。

2方法和结果

2.1维生素B6的含量测定

2.1.1色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流 动 相：甲醇-0.04%庚烷磺酸钠(用冰乙酸调节pH至3.0)=20∶80；检测波长：291 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；进样量：20 μl。

2.1.2溶液的制备(1)对照品溶液：精密称定100.01 mg维生素B6对照品置10 ml棕色量瓶中，加适量流动相超声溶解，放冷后加流动相定容至刻度，摇匀即得10.001 mg/ml维生素B6对照品溶液。(2)供试品溶液：取珍珠维E乳膏约1 g，精密称定，置100 ml烧杯中，加流动相30 ml，置99.5 ℃水浴中加热，充分搅拌使其溶解，再置冰浴中冷却2 h后，用定量滤纸滤入100 ml量瓶中。同法提取3次。将滤液合并入100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。滤液再用0.45 μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液2.5 ml，置10 ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀后作为供试品溶液。由于甲醇有毒且易挥发，因此以上操作均在通风橱中快速完成，实验人员须戴口罩。(3)阴性对照溶液：按本品处方制备不含维生素B6的空白乳膏，再按供试品溶液制备方法操作，得到阴性对照溶液。

2.1.3专属性实验按照2.1.1项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液20 μl进样测定，得到色谱图见图1。由图1可见，供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处有相同的色谱峰，而阴性对照溶液在此处无吸收峰，表明专属性良好。

图1　珍珠维E乳膏中维生素B6的HPLC谱图Figure 1　HPLC photograms of vitamin B6 in Pearl vitamin E creamA：阴性对照溶液；B：对照品溶液；C：供试品溶液

2.1.4标准曲线的制备精密量取2.1.2(1) 项下的维生素B6对照品溶液1 ml置100 ml棕色量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀即得100.01 μg/ml维生素B6对照品溶液。分别精密量取此溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流动相稀释，定容至刻度，摇匀，得到系列浓度为5.000 5、10.001、20.002、40.004、80.008、100.01 μg/ml的维生素B6对照品溶液。按2.1.1项下色谱条件进样20 μl，测定峰面积(A)，对浓度(c)进行线性回归，计算得到标准曲线方程为：A=52 173c+2 858.5(r=1.000 0)，表明维生素B6在5.000 5～100.01 μg/ml范围内线性关系良好。

2.1.5精密度实验(1)日内精密度：精密吸取2.1.4项下浓度为20.002 μg/ml的维生素B6对照品溶液20 μl，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，由峰面积计算得到日内RSD=0.64%(n=6)。(2)日间精密度：精密吸取2.1.4项下浓度为20.002 μg/ml的维生素B6对照品溶液20 μl，每天测定1次，连续测定5 d，根据峰面积计算得到日间RSD=0.77%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.1.6稳定性实验按2.1.2(2)项下方法制备供试品溶液，在0、2、4、6、8 h分别进样测定，记录峰面积，计算得到RSD=0.75%(n=5)，表明供试品溶液在配制后8 h内稳定。

2.1.7重现性实验取同一批号(131008)珍珠维E乳膏样品5份，按2.1.2(2)项下方法制备5份供试品溶液，以2.1.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积。计算得到维生素B6的含量为标示量的97.77%，RSD=0.42%(n=5)，表明该方法的重现性良好。

2.1.8回收率实验精密称定9份不含维生素B6的空白乳膏各1 g，分别加入已知浓度的维生素B6对照品适量，制备成维生素B6含量相当于标示量80%、100%、120%(80.008、100.01、120.012 μg/ml)的模拟样品。按照2.1.2(2)项下方法制备供试品溶液，测定含量并计算回收率。结果低、中、高浓度的平均回收率分别为(97.46±1.30)%、(99.00±0.34)%、(98.09±0.56)%(n=3)。

2.1.9样品含量测定取3个批号(131008、131104、131105)的珍珠维E乳膏，按2.1.2(2)项下方法制备供试品溶液，以2.1.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积。计算得到3个批号珍珠维E乳膏中的维生素B6含量分别为标示量的(97.54±0.38)%、(93.27±1.67)%、(92.34±0.37)%(n=3)。

2.2维生素E的含量测定

2.2.1色谱条件ACE-121-1546 C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水=95∶5；检测波长：285 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；进样量：20 μl。

2.2.2溶液的配制(1)对照品储备液：精密称取维生素E对照品0.319 6 g，置100 ml量瓶中，加无水乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为3.196 mg/ml的维生素E对照品储备液。(2)供试品溶液：精密称取珍珠维E乳膏约3.0 g，置烧杯中，加无水乙醇25 ml，置80 ℃水浴上加热，充分搅拌使其溶解，再置冰浴中冷却2 h后，用定量滤纸滤入100 ml量瓶中，同法提取3次。将滤液合并入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。滤液再用0.45 μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液2 ml，置10 ml量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，即得供试品溶液。(3)阴性对照溶液：精密称取不含维生素E的空白乳膏约3.0 g，置烧杯中，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.2.3专属性实验按照2.2.1项下色谱条件，分别吸取维生素E对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μl进样测定，得到色谱图见图2。由图2可见，维生素E与流动相峰分离清晰，表明专属性良好。

2.2.4标准曲线的制备

图2　珍珠维E乳膏中维生素E的HPLC谱图Figure 2　HPLC photograms of vitamin E in Pearl vitamin E creamA：阴性对照溶液；B：对照品溶液；C：供试品溶液

精密量取2.2.2(1)项下维生素E对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml分别置50 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得到系列浓度为31.96、63.92、127.84、191.76、255.68 μg/ml的维生素E对照品溶液。精密吸取各浓度的对照品溶液各20 μl，按照2.2.1项下色谱条件进样，测定峰面积。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线，经线性回归得到标准曲线方程：A=5 347.5c-215.02(r=0.999 9)。结果表明，维生素E在31.96～255.68 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.5精密度实验(1)日内精密度：精密吸取2.2.4项下浓度为63.92 μg/ml的对照品溶液20 μl，按照2.2.1项下色谱条件连续进样6次，由峰面积计算维生素E的日内RSD为0.26%(n=6)。(2)日间精密度：精密吸取2.2.4项下浓度为63.92 μg/ml的对照品溶液20 μl，每天测定1次，连续测定5 d，记录峰面积，计算得到日间RSD=0.61%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性实验按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h各进样1次，记录峰面积，计算得到RSD=0.49%(n=5)，表明供试品溶液在配制后8 h内稳定。

2.2.7重现性实验取同一批号(131008)珍珠维E乳膏5份，按2.2.2(2)项下方法制备5份供试品溶液，以2.2.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积，计算得到维生素E的含量为标示量的99.0%，RSD=0.40%(n=5)，表明方法的重现性良好。

2.2.8回收率实验精密称取9份不含维生素E的空白乳膏各3.0 g，分别加入已知浓度的维生素E对照品适量，制备成浓度相当于标示量80%、100%、120%(51.14、63.92、76.70 μg/ml)的模拟样品，按照2.2.2(2)方法制备供试品溶液，测定含量并计算回收率。结果低、中、高浓度的回收率分别为(100.04±1.57)%、(100.02±0.30)%、(102.92±0.56)%(n=3)。

2.2.9样品含量测定取3个批号(131008、131104、131105)的珍珠维E乳膏，按2.2.2(2)项下方法制备供试品溶液，以2.2.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积。计算得到3个批号的珍珠维E乳膏中的维生素E含量分别为标示量的(99.75±1.24)%、(98.83±1.49)%、(101.60±1.81)%(n=3)。

3讨论

3.1提取方法的确立在样品提取方法考察过程中，为了得到良好的破乳效果和符合要求的提取率，本研究分别以流动相和无水乙醇作为维生素B6和维生素E的提取溶剂，在水浴加热下使其提取完全，再通过冰浴冷却除去乳膏剂中的基质，减少对色谱柱的污染，从而获得相对理想的提取效果。

3.2检测方法的选择本研究在选择检测方法时曾参考文献[1]，按其方法同时测定维生素B6和维生素E的含量，发现结果并不理想。维生素B6为水溶性维生素，在水中易溶，在乙醇中微溶[2]；而维生素E是脂溶性维生素，在无水乙醇中易溶，在水中不溶[2]。两种不同极性的药品同时用90%乙醇提取，提取不完全，会影响检测结果。考察到两种主成分的极性相差较大，本研究采用HPLC法分别用不同的溶剂提取、不同的检测条件测定，得到比较满意的结果。

3.3检测波长的选择本研究参考文献[2，3]及检测器的紫外扫描结果发现，维生素B6在291 nm处有最大吸收，故选取291 nm作为其检测波长。维生素E在212和285 nm波长处有最大吸收，但在212 nm波长处杂质峰的影响较大，故最终选取285 nm作为其检测波长。

3.4流动相的选择本研究在测定维生素B6含量时参考文献[2，3]的流动相条件，发现各峰分离度较好，但出峰时间较长。最后选用本文的流动相条件，发现各峰分离度较好，且出峰时间适中。在测定维生素E时参考文献[4-6]，并对文献中提到的各种流动相分别进行了考察，结果发现以甲醇-水(95∶5)作为流动相时分离度较好，出峰时间适中，因此以其作为测定维生素E的流动相。

【参考文献】

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[修回日期]2015-04-06

[本文编辑]兰芬

Determination of vitamin B6and vitamin E contents in Pearl vitamin E cream by HPLC method

CHEN FangJian，LU SongWei，SONG HongJie*，GAO HongBin，QUAN ShanCong,LUO JinQian

(Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC method for the determination of vitamin B6 and vitamin E contents in Pearl vitamin E cream.Methods: The separation of vitamin B(6 )was performed on Kromasil C(18 )column(150 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was composed of methanol-0.04% sodium heptane sulfonic solution(pH adjusted to 3.0 with glacial acetic acid，20∶80) and the detection wavelength was 291 nm.The separation of vitamin E was performed on ACE-121-1546 C(18) column (150 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was composed of methanol-water(95∶5) and the detection wavelength was 285 nm.The flow rate of the mobile phase was 1.0 ml/min and the column temperature was set at room temperature.Results: Vitamin B(6 )was in good linearity within the range of 5.000 5-100.01 μg/ml(r=1.000 0).The average recoveries of low,moderate and high concentrations(80%,100%,120% of the labeled content) were (97.46±1.30)%,(99.00±0.34)% and (98.09±0.56)%(n=3),respectively. Vitamin E was in good linearity within the range of 31.96-255.68 μg/ml (r=0.999 9).The average recoveries of low,moderate and high concentrations(80%,100%,120% of the labeled content) were (100.04±1.57)%,(100.02±0.30)% and (102.92±0.56)%(n=3),respectively.Conclusion: The method is accurate，sensitive，selective and reproducible.It can provide reference for the improvement of the quality standard of Pearl vitamin E cream.

[KEY WORDS]Pearl vitamin E cream;vitamin B6;vitamin E;content determination;chromatography,high performance liquid

[收稿日期]2014-08-04

DOI：10.5428/pcar20150313

[中图分类号]R972.2

[文献标志码]A

[文章编号]1671-2838(2015)03-0201-04

作者简介陈方剑(女)，主管药师.E-mail:ngchenfangjian@126.com;陆松伟(男),主管药师.E-mail:chinalsw2000@sina.com；两人为共同第一作者*通信作者(Corresponding author)：宋洪杰，E-mail:h_jsong@126.com

基金项目总后勤部卫生部军队医疗机构制剂标准提高科研专项(13ZJZ11-3)