黄酮醇糖苷及其结构类似物的质谱裂解规律研究

郑国帅，赵　鑫，范国荣

[1.安徽中医药大学药学院中药资源学教研室，合肥 230031；2.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物重点实验室，上海 200433]



·论著·

黄酮醇糖苷及其结构类似物的质谱裂解规律研究

郑国帅1,2，赵鑫2*，范国荣2

[1.安徽中医药大学药学院中药资源学教研室，合肥 230031；2.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物重点实验室，上海 200433]

[摘要]目的：研究创新药物3′,4′-二甲氧基黄酮醇-D-葡萄糖苷(GDH)及其结构类似物的质谱裂解规律。方法：在正、负离子检测模式下，对GDH及其结构类似物进行电喷雾离子阱质谱(ESI-MSn)分析，并用Mass Frontier 6.0软件辅助解析其中主要的特征碎片离子，以及可能的裂解途径。结果：在正离子模式下，从3-羟基-3′,4′-二甲氧基黄酮醇(NDH21)获得m/z 299、284、266、239、238、165、137等特征离子；从GDH获得m/z 483、461、321、299等特征离子；从3-乙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黄酮(NDH01)获得m/z 363、321、306等特征离子；从3-丙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黄酮(NDH02)获得m/z 377、321、306等特征离子；从3，3′,4′-三甲氧基黄酮(甲基化NDH21)获得m/z 335、320、305等特征离子。在负离子模式下，从NDH21、GDH、NDH01、NDH02和甲基化NDH21均获得m/z 297、282、267等特征离子。结论：在正离子模式下，除了NDH21显示较强的[M+H]+外，GDH及其他结构类似物均显示较强的[M+Na]+加合离子峰，主要产生丢失C环3-OH上取代基的碎片信息；除GDH外，其他黄酮醇糖苷类似物进一步产生丢失B环甲基的裂解途径。在负离子模式下，NDH21生成[M-H]-，GDH及其他结构类似物主要通过丢失C环3-OH上取代基发生裂解，并且同样出现丢失B环甲基的裂解途径。

[关键词]黄酮醇糖苷；电喷雾离子阱质谱；裂解规律

[Pharm Care Res，2015，15(3): 196-200]

黄酮醇葡萄糖苷(flavonol glucose glycoside)是一类新合成的黄酮醇类降血脂药物，可用于防治高血压和脑溢血等疾病[1,2]。该类化合物是在3-羟基-3′,4′-二甲氧基黄酮醇(NDH21)的基础上进行结构修饰得到[3](结构图见图1)，已经申请获得国家专利[4]。虽然对黄酮类化合物进行质谱分析的报道较多[5,6]，但对于新合成的黄酮醇结构类似物GDH、3-乙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黄酮(NDH01)、3-丙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黄酮(NDH02)、3-羟基-3′,4′-二甲氧基黄酮醇(NDH21)及3，3′,4′-三甲氧基黄酮(甲基化NDH21)的质谱解析和裂解规律，国内外未见报道。电喷雾离子阱质谱(electrospray ion trap tandem mass spectrometry,ESI-MSn)可以为黄酮醇类化合物提供准分子离子峰及多级结构信息，从而推测其裂解规律[7]。本研究采用ESI-MSn对5种黄酮醇结构类似物进行分析，并以Mass Frontier 6.0软件综合分析5个化合物的准分子离子峰、特征碎片离子、质谱特征与结构信息，对质谱裂解规律进行比较，为研究GDH在动物体内的代谢过程及进一步的结构修饰提供参考。

中文名称R缩写名称3-羟基-3',4'-二甲氧基黄酮醇H-NDH213',4'-二甲氧基黄酮醇-D-葡萄糖苷Glu-GDH3-乙酰氧基-3',4'-二甲氧基黄酮CH3C(O)-NDH013-丙酰氧基-3',4'-二甲氧基黄酮CH3CH2C(O)-NDH023,3',4'-三甲氧基黄酮CH3-甲基化NDH21

图1黄酮醇糖苷及其结构类似物的化学结构式

Figure 1Chemical structures of flavonol glucose

glycoside and its structural analogues

1材料和方法

1.1仪器LCQ Fleet 质谱仪，包括ESI 离子源、

离子阱质量分析器、XcaliburTM 2.0.7 SP1 数据处理软件、Mass Frontier 6.0软件(美国Thermo Fisher公司)；XS205DU 十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；S0200-230V-EU涡旋混合器(美国Labnet公司)。

1.2试剂和药品GDH、NDH01、NDH02、NDH21、甲基化NDH21对照品(纯度>99.0%，第二军医大学有机化学教研室提供)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)。

1.3样品溶液的配制精密称取GDH对照品10 mg，置于10 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得GDH对照品储备液。精密量取GDH对照品储备液适量，用甲醇稀释至1.0 μg/ml，得GDH供试品溶液。同法配制1.0 μg/ml的NDH01、NDH02、NDH21和甲基化NDH21供试品溶液。

1.4质谱条件离子源喷射电压：4.5 kV，透镜电压：90 V，毛细管电压：-1.0 V，毛细管温度：350 ℃，鞘气流速：12 L/min(40.0 arb)，辅助气流速：2.4 L/min(8.0 arb)。

1.5ESI-MSn分析取上述1.0 μg/ml的GDH及其他黄酮醇结构类似物供试品溶液，采用直接进样方式导入ESI离子源，先采用一级全扫描方式获得待测物的准分子离子峰，然后选择准分子离子峰和碎片离子峰进行多级质谱分析，获得相应的多级质谱图。

2结果和分析

2.1NDH21的ESI-MSn分析结果在正、负离子模式下 NDH21 的 ESI-MSn图谱见图 2。

图2　NDH21的ESI-MSn谱图Figure 2　The ESI-MSn spectra of NDH21A、B、C：正离子模式；D、E、F：负离子模式；A、D：一级质谱图；B、E：二级质谱图；C、F：三级质谱图；NDH21：3-羟基-3′,4′-二甲氧基黄酮醇

由图 2 A可见，NDH21产生较强的准分子离子峰m/z299[M+H]+，以及较弱的m/z321[M+Na]+。图2B是对m/z299碎片离子的二级质谱扫描结果，产生m/z284、266、239、165、137的碎片离子峰。图2C是对m/z284碎片离子的三级扫描结果，产生m/z266和238的碎片峰。图2D～F是负离子模式下NDH21的ESI-MSn图谱。一级质谱扫描得到NDH01的准分子离子峰m/z297 [M-H]-，二级质谱扫描得到m/z282碎片离子峰，对其进行三级质谱扫描，得到m/z267、254、239的碎片离子峰。正、负离子模式下NDH21的裂解途径见图3。

图3　NDH21的质谱裂解途径Figure 3　The mass fragmentation pathway of NDH21NDH21：3-羟基-3′,4′-二甲氧基黄酮醇

2.2GDH的ESI-MSn分析结果正、负离子模式下GDH的ESI-MSn图谱见图4。由图4可见，在正离子模式下一级质谱扫描得到GDH准分子离子峰m/z461[M+H]+，以及加合离子m/z483[M+Na]+；对m/z483进行二级质谱分析，得到碎片离子峰m/z321；对m/z461进行二级质谱分析，得到很强的m/z299碎片离子峰。负离子模式下，GDH产生很弱的准分子离子峰m/z459[M-H]-，且出现较强的m/z297；对m/z297进行二级质谱分析，可见其碎片离子峰m/z282；进一步做三级质谱扫描，得到m/z267碎片离子峰。

图 4　GDH的ESI-MSn谱图Figure 4　The ESI-MSn spectra of GDHA、B、C：正离子模式；D、E、F：负离子模式；A、D：一级质谱图；B、C、E：二级质谱图；F：三级质谱图；GDH：3′,4′-二甲氧基黄酮醇-D-葡萄糖苷

图 5　GDH的质谱裂解途径Figure 5　The mass fragmentation pathway of GDHA:正离子模式下[M+Na]+与[M+H]+两种离子的裂解途径；B：负离子模式下[M-Glu]-离子的裂解途径；GDH：3′,4′-二甲氧基黄酮醇-D-葡萄糖苷

正离子模式下的一级质谱扫描显示，GDH主要形成[M+Na]+和[M+H]+，分别对两种加合离子进行二级质谱扫描，发现均丢失-Glu得到碎片离子峰m/z321和m/z299，进一步对上述离子进行三级扫描未发现有碎片生成。因此在正离子模式下，GDH的加合离子主要脱去1分子葡萄糖而生成二级碎片离子峰。负离子模式下的[M-H]-信号非常微弱，较强的m/z297与准分子离子峰之间亦相差了1分子葡萄糖，因此推断m/z297为GDH在负离子模式下断裂糖苷键获得。m/z297的二级质谱扫描中出现较强的碎片离子峰m/z282，m/z282的三级质谱扫描中出现较强的碎片离子峰m/z267、239，与NDH21相类似,因此推测GDH在负离子模式下与NDH21质谱裂解途径相同。正、负离子模式下GDH的裂解途径见图5。2.3NDH01的ESI-MSn分析结果正离子模式下NDH01的准分子离子峰m/z 341[M+H]+信号较弱，而加合离子峰m/z 363[M+Na]+信号较强。m/z 363的二级质谱显示其C环上醇羟基形成的酯键断裂并发生重排，生成m/z 321 [M+Na-CH2CO]+；三级质谱扫描的m/z 306是B环上-OCH3脱去-CH3后得到。正离子模式下NDH01的裂解途径见图6A。在负离子模式下NDH01的ESI-MSn图谱与GDH类似，提示负离子模式下两者具有相同的裂解途径。

2.4NDH02的ESI-MSn分析结果NDH02的准分子离子峰m/z 355[M+H]+信号较弱，而加合离子m/z 377[M+Na]+信号较强，其二、三级质谱信息与NDH01相同，裂解途径见图6B。负离子模式下NDH02的ESI-MSn图谱与GDH类似，提示其与GDH具有相同的裂解途径。

2.5甲基化NDH21的ESI-MSn分析结果正离子模式下甲基化NDH21产生较强的加合离子峰m/z 335[M+Na]+，以及较弱的准分子离子峰m/z 313 [M+H]+。m/z 335的二级质谱扫描获得了裂解碎片离子峰m/z 320,进一步裂解得到三级碎片离子峰m/z 305。可见二级和三级质谱扫描中的碎片离子峰是m/z 335先后丢失B环上-OCH3中的-CH3所致。正离子模式下甲基化NDH21的裂解途径见图6C。负离子模式下甲基化NDH21的ESI-MSn图谱与GDH类似，提示其与GDH具有相同的裂解途径。

3讨论

图6　NDH01、NDH02和甲基化NDH21在正离子模式下[M+Na]+的裂解途径Figure 6　The fragmentation pathways of [M+Na]+ of NDH01，NDH02 and methylated NDH21 in positive modeA：NDH01；B：NDH02；C：甲基化NDH21;NDH01：3-乙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黄酮；NDH02：3-丙酰氧基-3′,4′-二甲氧基黄酮；甲基化NDH21：3，3′,4′-三甲氧基黄酮

本研究采用ESI-MSn对创新药物GDH及其结构类似物NDH21、NDH01、NDH02、甲基化NDH21的质谱裂解规律进行研究，根据ESI-MSn正、负离子模式下产生的多级碎片离子，推测并比较上述黄酮醇结构类似物的裂解规律。在正离子模式下，NDH21的一级质谱显示出较强的[M+H]+准分子离子峰，而C环3-OH衍生化产物的一级质谱均显示出较强的[M+Na]+加合离子峰。NDH21结构中C环上3位为羟基，是典型的黄酮醇结构，其二级质谱中未见RDA裂解(黄酮类化合物C环上的两种裂解途径之一)的碎片，可能是由于B环4′-OCH3产生的共轭作用，使得C环上2位碳电子云密度增加，不利于电荷分散[8]。相比之下，GDH的C环3-OH形成糖苷键，其二级质谱主要呈现丢失1分子葡萄糖后的碎片离子，并且其三级质谱扫描无明显碎片离子。正离子模式下，C环上3-OH糖基化或酰化的化合物裂解首先丢失的是该结构上的糖基或者酰基，然后再丢失B环上的甲基；NDH01和NDH02二、三级质谱中的碎片离子与NDH21一、二级质谱中的碎片离子类似，而GDH则无三级质谱碎片信息。由此可见，糖苷化产物GDH对黄酮母体结构的保护最好，结构更加稳定；而C环上3位是甲氧基的甲基化NDH21则仅出现B环先后丢失甲基的裂解过程。在负离子模式下，GDH、NDH01、NDH02和甲基化NDH21的一级质谱中均未发现明显的准分子离子峰， 出现的基峰是C环上3-OH取代基丢失后的碎片离子峰m/z297，其二、三级质谱的碎片与NDH21一致，表明在负离子模式下，该类化合物具有相同的裂解规律。本研究对创新药物GDH及其结构类似物的质谱裂解规律进行了初步分析，为进一步研究该类化合物在体内的生物转化和基于NDH21的结构修饰提供了重要信息。

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[修回日期]2015-05-28

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Study on the mass fragmentation pathway of flavonol glucose glycoside and its structural analogues

ZHENG GuoShuai1,2,ZHAO Xin2*,FAN GuoRong2

[1.Department of Traditional Chinese Materia Medica Resources,School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230031,China;2.Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Second Military Medical University， Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical (Chinese Materia Medica) Metabolites Research，Shanghai 200433,China]

[ABSTRACT]Objective: To study the mass fragmentation pathway of 3′,4′-dimethoxy flavonol-D-glucose glycoside(GDH) and its structural analogues. Methods: GDH and its structural analogues were identified by electrospray ion trap tandem mass spectrometry(ESI-MSn) in positive and negative modes,respectively.The characteristic fragment ions and fragmentation pathways were explained with the aid of Mass Frontier 6.0 software. Results: In positive mode,ion peaks m/z 299，284，266，239，238，165，137 were detected for 3-hydroxy-3′,4′-dimethoxy flavonol(NDH21),m/z 483,461,321,299 for GDH,m/z 363，321，306 for 3-acetoxyl group-3′,4′-dimethoxy flavonoid(NDH01),m/z 377，321，306 for 3-propionyloxy-3′,4′-dimethoxy flavonoid(NDH02) and m/z 335，320，305 for 3, 3′,4′-trimethoxy flavonoid(methylated NDH21).In negative mode，ion peaks m/z 297,282,267 were all detected for GDH and its structural analogues． Conclusion: In positive mode,intensive ion fragment [M+Na]+ was detected in the mass spectra of GDH and its structural analogues,while NDH21 produced intensive molecular ion [M+H]+.The characteristic fragment ions were obtained through losing the substituent group of 3-OH on the C ring,and methyl group on the B ring of flavonoid was lost except GDH.In negative mode,molecular ion [M-H]- was detected for NDH21.GDH and its structural analogues were cracked through losing the substituent group of 3-OH on the C ring and methyl group on the B ring of flavonoid.

[KEY WORDS]flavonol glucose glycoside;electrospray ion trap tandem mass spectrometry;fragmentation pathway

[收稿日期]2015-03-20

DOI：10.5428/pcar20150312

[中图分类号]R284

[文献标志码]A

[文章编号]1671-2838(2015)03-0196-05

作者简介郑国帅(男)，硕士生.E-mail: zhengguo.shuai@163.com*通信作者(Corresponding author)：赵鑫，E-mail:yoyo0132@163.com