氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清代谢组学研究

王　凯，夏德萌，郝晓伟，高松燕，李　娜，许　旭，娄子洋*

(1.上海应用技术学院化学与环境工程学院，上海 201418；2. 第二军医大学学员旅，上海 200433；3. 第二军医大学药学院分析测试中心，上海 200433)



氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清代谢组学研究

王凯1，夏德萌2，郝晓伟2，高松燕3，李娜3，许旭1，娄子洋3*

(1.上海应用技术学院化学与环境工程学院，上海 201418；2. 第二军医大学学员旅，上海 200433；3. 第二军医大学药学院分析测试中心，上海 200433)

[摘要]目的：利用代谢组学方法对高尿酸血症小鼠模型进行代谢轮廓分析，以期寻找疾病生物标志物，为发现高尿酸血症发病机制及其与其他疾病的关系提供线索。方法：使用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾构建高尿酸血症小鼠模型，使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)技术对小鼠血清进行分析，利用多元统计分析方法筛选差异代谢物，并使用二级质谱分析或对照品对其进行确证。结果：共筛选出21个差异代谢物，涉及氨基酸、脂质、能量代谢物等。结论：本研究建立了基于液质联用技术的高尿酸血症小鼠模型的代谢组学分析方法，有助于从分子水平理解高尿酸血症的发病机制及其与其他疾病的关系。筛选出的部分代谢物具有成为高尿酸血症相关肾损伤早期诊断标志物的可能。

[关键词]高尿酸血症；代谢组学；氧嗪酸钾；超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱

[Pharm Care Res，2015，15(6): 416-421]

随着生活水平的提高，我国代谢性疾病的发病率不断攀升。最新流行病学调查显示，我国成年人高尿酸血症(hyperuricemia)患病率为8.4%，南方略高于北方，在经济发达省市，这一数据高达14.9%[1]。高尿酸血症不仅是痛风的生化基础，大量研究还表明其与肾功能障碍、心血管疾病、高血压、高脂血症、胰岛素抵抗、糖尿病、代谢综合征密切相关[2-4]。〗高尿酸血症已成为影响我国尤其是经济较发达地区的一个重要公共卫生问题。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后兴起的一种新的系统生物学方法，它通过考察生物系统受外界刺激后，体内新陈代谢紊乱导致内源性小分子物质含量的变化,来反映机体的状态。因此，在研究代谢性疾病、筛选疾病标志物、从分子水平理解疾病的发病机制上代谢组学方法具有独特的优势[5]。作者应用基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)技术的代谢组学方法，对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠模型进行了研究。

1材料

1.1仪器和试药UHPLC-Q-TOF/MS采用安捷伦1290 Infinity 液相系统和安捷伦6538四极杆-飞行时间串联质谱仪(美国Agilent公司)；XSELECT HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm,美国Waters公司)；METTLER AE240型十万分之一电子天平，METTLER TOLEDO 酸度计(德国梅特勒公司)；低温离心机(美国Thermo公司);氧嗪酸钾(上海阿达玛斯公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；L-2氯苯丙氨酸(美国Sigma-Aldrich公司)；甲酸(色谱纯，瑞士Fluka公司)。尿酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2实验动物SPF级昆明小鼠18只，雄性，体重(20±2) g(上海斯莱克实验动物有限公司)。实验动物合格证号SCXK(沪)2012-0002。

2方法

参考文献2.1氧嗪酸钾溶液的配制[6]，准确称取氧嗪酸钾600、1200 mg,分别加入到36 ml生理盐水中，使用极少量3 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.4～7.6，即得给药浓度为250、500 mg/kg的氧嗪酸钾溶液。

2.2实验分组和高尿酸血症模型的建立小鼠实验前适应性饲养一周，在整个实验过程中自由饮水和取食。按随机数字表法分为对照组、低剂量模型组、高剂量模型组，每组6只。采用腹腔注射尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾诱导产生高尿酸血症[6]。给药前1 h禁食，不禁水。对照组腹腔注射生理盐水；低、高剂量模型组分别腹腔注射250、500 mg/kg氧嗪酸钾溶液，给药体积15 ml/kg，连续给药7 d。

2.3生物样本的采集与检测在第6天给药后，禁食24 h，不禁水。第7天给药2 h后，小鼠摘眼球取血，血样室温自然凝结1 h后，4 ℃, 1.5×103×g离心5 min，取血清，-80 ℃保存直到分析。

2.4代谢组学样品前处理准确称取L-2氯苯丙氨酸适量，配成2.5 mg/ml的水溶液，用纯甲醇稀释成浓度为12.5 μg/ml的L-2氯苯丙氨酸溶液，作为内标溶液。

血清样品4 ℃解冻，每份样品吸取100 μl血清于1.5 ml EP管内，加入300 μl内标溶液除蛋白质，涡旋5 min后在4 ℃冰箱静置10 min,随后在4 ℃下16.2×103×g离心15 min，吸取200 μl上清液进样分析。

2.5色谱和质谱条件色谱分离在XSELECT HSS T3柱上进行,柱温40 ℃，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脱：0～2 min 5%B；2～13 min5%～95%B；13～15 min 95% B。流速0.4 ml/min，进样量4 μl。

质谱配置电喷雾离子源(ESI)，质谱条件为：正模式下毛细管电压为4 kV,负模式下3.5 kV。气体温度350 ℃，流速11 L/min。喷雾电压310.3 kPa(45 psi，1 psi=6.895 kPa)，Skimmer电压45 V,碎裂电压120 V。

UHPLC-Q-TOF/MS采集得到的原始数据利用安捷伦定性分析软件转化为通用格式(.mzdate)。随后在R软件上使用XCMS程序包进行峰的识别、校正和积分。80%筛选后保留一张不同样品关于不同变量的三维数据矩阵表，随后同一样品不同变量的峰面积除以该样品里加入的内标的峰面积进行面积归一化。随后导入SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Umea, Sweden)进行多元统计分析。使用有监督的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，进行差异物质的筛选，把VIP>1的变量作为显著差异物的候选变量。其次，利用面积归一化后的数据导入SPSS进行单因素方差分析和两两比较。把VIP>1、P<0.05的变量作为可能的差异代谢物。把这些可能的差异代谢物，在在线网络数据库metlin(http://metlin.scripps.edu)和HMDB(http://www.hmdb.ca)上进行初步鉴别。最后，对差异代谢物进行二级质谱分析，利用其碎片信息进一步确认。

3结果

3.1小鼠血清的尿酸检测结果结果表明，低剂量模型组与对照组相比，尿酸虽有升高，但未见统计学差异(P>0.05)；高剂量模型组与对照组相比，尿酸值显著升高(P<0.05)，具体见表1。结果显示，氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症模型构建成功，高剂量组诱导的效果明显优于低剂量组。

表1　小鼠血清尿酸检测结果

*P<0.05，与对照组比较

3.2血清代谢组学分析图1为典型的正、负离子模式下血清样品的质谱基峰图(BPC)。为了判断模型组和对照组的代谢轮廓是否有差异，使用PLS-DA法进行差异物质的筛选。图2为正、负离子模式下3组间的PLS-DA得分图。由图2可见，3组间均有较为显著的分离趋势，提示高、低剂量模型组与对照组相比，在内源性代谢物层面都发生了较明显的变化。为了进一步筛选高尿酸血症的潜在生物标志物，并明确其含量变化趋势，对对照组与高、低剂量模型组及两个模型组间分别进行两两比较。图3为两两比较的PLS-DA得分图，分离趋势良好。

图1　正离子模式(A)和负离子模式(B)下典型的血清质谱基峰图Figure 1　Typical mass spectrum base peak chromatograms of the serum samples obtained in ESI positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

图2　正负离子模式下对照组和模型组的PLS-DA得分图Figure 2　PLS-DA scores plots of the control group and the model group in positive ion mode and negative ion modeA:正离子模式；B：负离子模式；○:对照组；●：低剂量模型组；△：高剂量模型组

图3　对照组、低剂量模型组、高剂量模型组两两比较的PLS-DA得分图Figure 3　PLS-DA scores plots of the control group，the low dose model group andthe high dose model group by pairwise comparisonA1、B1、C1：正离子模式；A2、B2、C2：负离子模式；○：对照组；●：低剂量模型组；△：高剂量模型组

S图表示各个原始变量与第一主成分的相关性以及在第一主成分中的重要性。图中每一个点代表一个原始变量，离原点越远的点被认为与第一主成分的相关性越大，在组间贡献率也越大。VIP值常用来描述变量在组间的贡献率，贡献率越大则VIP值越大，该变量在组间比较中区分组间差异起到的作用就更显著。 图4为对照组和高剂量模型组的S图。

图4　正负离子模式下对照组和高剂量模型组的S图Figure 4　S-plot of the control group and the high dose model group in positive and negative ion modeA:正离子模式；B：负离子模式

把通过PLS-DA找到的VIP>1的变量，与经过SPSS处理找到的P<0.05的变量取交集，再根据质荷比在网络数据库上检索这些共有的变量，以此来鉴别差异代谢物。随后使用二级质谱分析对鉴别到的差异代谢物进行确证，并根据峰面积比较它们的含量在组间的变化趋势。表2显示了鉴别到的差异代谢物及其含量在组间的变化趋势。共鉴别出21个差异代谢物，其中14个利用二级质谱分析得到了确证。其中脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸进一步利用对照品进行了确证。以m/z166.086([M+H]+)为例说明差异代谢物的二级质谱确证过程。在网络数据库中检索166.086并结合Masshunter软件的分子式推测，检索可能的差异代谢物，随后样品进行二级质谱分析,对鉴别到的差异代谢物进行二级质谱分析,得到关于该差异代谢物在不同能量下二级质谱碎片图谱(见图5B2，10 eV),通过与在线网络数据库(如metlin)里该物质的二级质谱碎片进行比对，来确证该差异代谢物。图5为苯丙氨酸样品与对照品的比对示例。

与对照组相比，模型组中氨基酸和左旋肉碱代谢均下调，但左旋肉碱的酯类化合物大多是上调的。图6利用热图形象化地显示了鉴别到的21个差异代谢物在对照组，低、高剂量模型组中相对含量及变化趋势。由图6可见，与对照组相比，模型组差异代谢物颜色显著不同，说明模型组和对照组差异代谢物含量不同。

表2　潜在的生物标志物及其含量变化趋势

↑：差异代谢物含量的上调；↓：差异代谢物含量的下调；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与对照组比较;△△P<0.01，△△△P<0.001，与低剂量模型组比较

图5　样品和对照品中苯丙氨酸的提取离子色谱图(A)和二级质谱图(B,碰撞电压10 eV)Figure 5　Extracted ion chromatograms(A) and MS/MS spectrums(B) of phenylalanine in sample and standard solution(the collision voltage was 10 eV)A1、B1：对照品；A2、B2：样品

3讨论

尿酸是人体嘌呤代谢的终产物。与其他哺乳动物不同，人和猿类在进化过程中由于编码尿酸酶基因的缺失，不能合成有活性的尿酸酶把尿酸代谢为溶解度好的尿囊素通过肾脏排出体外[7]，从而使高尿酸血症的发生成为可能。氧嗪酸钾结构与尿酸的嘌呤环相似,可部分抑制尿酸酶的活性,减少尿酸的分解，常被用来诱导产生高尿酸血症模型[6]。本研究表明，当氧嗪酸钾给药剂量为500 mg/kg时，成功诱导出小鼠高尿酸血症模型。而当给药剂量为250 mg/kg时，血清尿酸值升高但未见统计学差异，但从代谢物变化的层面上看，低剂量模型组鉴别到的差异代谢物和它们的变化趋势与高剂量模型组基本一致。发生这种情况的原因是氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症只能短期升高尿酸[8]，当剂量为250 mg/kg时，小鼠血清尿酸在2 h后已基本恢复正常，但尿酸升高对机体代谢造成的紊乱已经发生。代谢组学作为一种灵敏的关注内源性代谢物变化的系统生物学方法,能够较为准确地反映机体代谢状态的变化。

图6　在对照组，低、高剂量模型组血清中差异代谢物相对含量的热图分析Figure 6　Heatmap based on the relative levels of different metabolites in serum samples of the control group, the low model group and the high model group

人体中的尿酸盐主要通过肾脏排泄(占排泄总量的60%～70%)，少量经过肠道内的微生物菌群分解排泄[7]。尿酸盐的肾脏排泄需要多种转运蛋白的参与[7,9]。研究表明,高尿酸血症在肾脏疾病的发生和发展中起着重要作用[9]，高尿酸血症导致肾转运蛋白表达异常和肾损伤[10]。本研究结果显示，多种氨基酸在高尿酸血症模型组中有下调趋势，脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、别异亮氨酸、苯丙氨酸等的代谢异常提示与肾转运蛋白异常表达相关。L-2-哌啶酸是赖氨酸的降解产物，L-2-哌啶酸的下调可能也暗示赖氨酸的降低。色氨酸及其代谢物的变化与肾脏功能的异常密切相关[11,12]。在本研究中，模型组的色氨酸代谢也表现出明显的异常，这也提示了尿酸水平升高对肾脏功能的影响。目前，临床用于评价肾功能的指标，如肌酐、尿素氮等存在灵敏度低、前瞻性差的问题，如何早期发现肾脏功能的异常并给予干预已经成为一个重要课题。通过代谢组学方法筛选到的内源性代谢物具有较高的灵敏度，具备成为早期诊断肾脏功能的生物标志物的潜力。但这些内源性代谢物还需要不断地验证和确认才能逐渐被应用于临床。

高尿酸血症与心血管疾病密切相关。马文峰等[13]利用代谢组学技术研究了高尿酸血症病人与健康人血浆的代谢差异情况，发现脂质代谢异常是与高尿酸血症相关的代谢特征之一。本研究结果也显示了多种甘油磷脂类物质的异常，提示尿酸升高导致的脂质代谢的紊乱与心血管疾病的关联。左旋肉碱具有多种生理作用,通过转运长链脂肪酸到线粒体基质,在长链脂肪酸的线粒体氧化中保持辅酶A的内平衡,在细胞能量代谢中发挥重要作用。肾脏在左旋肉碱合成和维持左旋肉碱的平衡方面具有重要作用,同时也需要大量能量进行正常的代谢[14]。左旋肉碱的下调和肉碱酯类的变化可能暗示线粒体功能的紊乱和肾脏的异常，为从分子层面理解疾病的机制提供了重要线索[15]。

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[修回日期]2015-11-19

[本文编辑]阳凌燕

药学服务与研究杂志社与北京世纪超星信息技术发展有限责任公司签署学术期刊“域出版”合作协议

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·论著·

Serum metabonomics of hyperuricemia induced by potassium oxonate in mice

WANG Kai1,XIA DeMeng2,HAO XiaoWei2,GAO SongYan3,LI Na3,XU Xu1,LOU ZiYang3*(1.School of Chemical and Environmental Engineering,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China;2.Graduate Management Unit, Second Military Medical University,Shanghai 200433,China; 3.Pharmaceutical Analysis Center,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

[ABSTRACT]Objective: To analyze the metabolic profile of the mouse model of hyperuricemia by using metabonomics approach, so as to find out the biomarkers of the disease and provide evidence for the pathogenesis of hyperuricemia and the relationship with other diseases. Methods: The hyperuricemia mouse model was developed by using potassium oxonate, a uricase inhibitor. Serum was analyzed by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF/MS). Then, multivariate statistical analysis was made to identify different metabolites, which were determined by MS/MS or reference substances. Results: Twenty-one metabolites were identified as potential biomarkers, involving amino acid, lipids and energy metabolites, etc. Conclusion: The study successfully established the method for metabolomics in the hyperuricemia mouse model by using LC-MS technique, which would facilitate to understand the pathogenesis of hyperruricemia and the relationship with other diseases. Certain screened-out metabolites might be potential biomarkers for early diagnosis of kidney injury related with hyperruricemia.

[KEY WORDS]hyperruricemia; metabonomics; potassium oxonate; UHPLC-Q-TOF/MS

[收稿日期]2015-07-30

通信作者*(Corresponding author)：娄子洋，E-mail: ziyanglou@163.com

作者简介王凯(男)，硕士生.E-mail:chemwanderer@163.com;夏德萌(男).E-mail:demengxia@163.com；两人为共同第一作者

基金项目国家自然科学基金(81373377)

DOI：10.5428/pcar20150606

[中图分类号]Q591，R589.7

[文献标志码]A

[文章编号]1671-2838(2015)06-0416-06